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70min
肿瘤手术标本
转录因子
33KDa
PVDF膜
350mA恒流
150min
转膜设备:
湿转Bio-Rad
说明:
相同条件曾用于数个30-70KDa的蛋白,都能成功转上,不过没有试缩短时间效果如何;
实验时没为转膜条件苦恼,倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。
成纤维细胞
smad3
54KDa
胰腺癌细胞
16KDaand42KDa
120V恒压
90min
大鼠血管平滑肌细胞
72KD,42KD和22KD
一般的PVDF膜
湿转,恒流一张膜0.26A,两张膜0.3A。
转膜缓冲液最多用3次,最好现用现配,我们用的没有加SDS,转的时候最好能用冰块一类的东西降一下温,这样转的效果要好一些,转的时候一定要把XX治每层之间的气泡除去,同时使滤纸大于膜,膜大于胶,以免烧坏电极。
大鼠PBMC
55KD
0.22的PVDF膜
转膜方式〔恒流:
湿转
60-90min
转膜液用过两三次之后转膜效果就很差了其它按照常规就好了
其实0.22的膜一般不怕转过头以我们的经验,转膜时间、电压其实也有很大范围的调整,并不是非要固定于哪一个最合适,曾经做过
一张膜转,17KD的和170KD的,按照170KD的条件,17KD的转膜也很好的。
人非小细胞肺癌细胞系
大于250kD
milliporePVDF膜0.45um
湿转,恒流0.3A。
180min
Bio-Rad"
电转保持电压在70V以上,保持低温,如果电压低过70就需要换缓冲液了。
白血病细胞
28KD
0.45的NC膜
湿转,90min,0.25A
海绵厚度要合适,一次转磨用的海绵太薄,导致XX治没夹紧,转膜后拿出来一看,marker都变得七扭八歪。
但是有前辈说垫的海绵太厚可能将胶压断,没经历过,不知道是不是会有这种情况。
肿瘤细胞
磷酸化蛋白
10-200KDa
120v恒压
120min
转膜缓冲液只用2次,基本都转上,5%BSA封闭,减少背景。
胰腺β细胞
******
90-130KDa
250mA恒流
原核表达
38KD
湿转恒压:
100V
心脏
220kDa,130kDa,70kDa,41kDa
恒压
70v120min,180min,5-6h
伯乐湿转
建议改进方向〔可选:
40kDa一下,70v,60-90min足够,40-70kDa90-120min即可。
70-120kDa,70v,120-180min足够,120-180kDa,180-240min,180kDa以上建议6h。
卵巢癌细胞膜蛋白
53KD
PVDF膜0.45um
80V100min
人宫颈癌HELA细胞总蛋白
β-actin
42
504h
脑组织
16KD、27KD、32KD、42KD
PVDF0.22um
半干转恒流1mA/cm2或2mA/cm2
不定
北京六一仪器
我共做了六个蛋白,所以总在想节约时间的方式。
在预试时我会观察电压数与转膜效率的关系,所以我不会按时间来定何时转完,而是按电压来定。
通过染胶来确定电压数与转移蛋白分子量上限的关系。
这样有的5分钟就转完了,不用多浪费时间。
并且六一的半干转膜仪随着使用次数的增多,效率也会下降,所以时间和转膜效率〔尤其是使用后期的关系并不稳定,单纯依靠时间有时会有问题。
CHOcell
酶原
40KD
0.22的PVDF膜〔Biorad
转膜方式〔恒压:
100V,湿转,转膜时间:
60min。
Tanon〔上海天能
1.
转膜液现用现配,用完倒掉。
2.
转膜时间,电压可以适当调整。
分子量大或者小一些的蛋白,采用此条件一样转膜效率很高。
Hepg2
EGFR
170kd
pvdf0.45
24V
2个半小时
伯乐半干转
肝癌细胞
蛋白名称:
HIF-1α
120kD
NC膜
80伏,湿转
150分钟
建议:
湿转,转膜液特别重要,否则会导致电压或者电流不稳影响转膜条带。
转膜均现配先用,不重复利用。
转膜时间一般是150分钟,80伏恒压。
经李春红染色,靠近蛋白胶的一侧膜上蛋白染色深,膜另外一面染色浅,说明蛋白未转过。
该湿转条件自己做过的蛋白分子量范围:
170-36kD。
心肌细胞总和膜
128KD,100,60,55,43KD
NC膜0.2um
70V200min
转膜液最好现配现现用,或配成母液,最好不重复使用,70V电压下,电流约154mA。
甲醇可以加到150ml。
对大分子量如200KD转膜时间延长6-8h。
肺脏
ICAM-1
85~110KD
0.22NC
湿转恒流300mA
设备名字Bio-Radmini
一抗用的santacruz1mL包装的。
比例调整到1:
800做出很好的条带。
效价会一直降低的。
去年做的这个指标,今年夏天做就不行了。
16KDa
0.2umPVDF膜
0.2A恒流
65min
28KDa
0.2umPVDF膜
0.25A恒流
60min
人肿瘤细胞
80KD
0.45umPVDF膜
半干转移系统恒流,勿超过0.85mA/cm2,同时转多张膜电流需累加〔串联
Bio-Rad
其实有些东西并不是非常严格的,要转移的目的蛋白分子量小,那么转移的时间就短一些,反之,则长一点;
蛋白量充足,可以多转一会,蛋白量较少,则要少转一下,免得蛋白穿膜而过到了滤纸上而前功尽弃。
人和鼠肝癌细胞总蛋白、胞浆、胞核蛋白
***
17--116kd
恒流200mA
3h
湿转北京六一24Dmini
COCOS7293T
80725652482518KD
湿转90V电流约为230--280mA之间。
两张膜串联叠加。
40min
Bio-Rad法码西亚
30-60KDa
pallNC膜0.45um
恒流0.85-1mA/平方厘米膜
转膜设备:
北京六一半干转
转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成2倍的母液,转膜液的多少会影响电转的效率,一般将吸水纸润湿即可,不要和膜一起浸泡,这样效果很好。
人肝癌肿瘤细胞
notch
60-120KDa
恒流0.3A
-20度冰柜120min
湿转Bio-Rad
转膜缓冲液用新鲜配制的,可先配成10倍或5倍的母液,保持低温是转膜效果的一个保证,这样效果很好。
胶质瘤细胞总蛋白和核蛋白
18KDa、36KDa、55KDa、98KDa
NC膜PALL
0.35恒流
湿转Bio-Radmini
转缓液的配制有点讲究。
如果蛋白大于一百多,一般加入SDS,时间延长结果会更好些。
由于,目前试验的蛋白就都不大,所以,我们都采用不加SDS的转缓液,跑出来的条带也很整齐、干净。
蛋白来源大肠癌205
92kd,43kd
0.45pvdf
湿转,天能。
大鼠脑组织
BDNF〔28KDa、Bactin〔42KDa、LaminB〔72KDa,以及磷酸化蛋白〔保密43KDa
PVDF〔0.45膜
300mA恒流
湿转Bio-RadMini
转膜缓冲液:
25%甲醛觉得这个浓度的甲醛可以有效降低电转的热量,而且使膜对蛋白的吸附效果较好,Marker转到膜上很鲜艳。
用立春红染色效果也很好。
表达产物
29KDa
0.3A恒流
80min
celllysate,culturemedium
15-50kD
NC,PVDF,0.45um
恒压,semi-dry
about2hisokiftheproteinissmallandthevoltagecankeep100V,ifnotincreaseto3-4h。
Bio-Rad
肺脏、肝脏等。
actin
43kD
NC膜PALL0.22um
湿转恒流200mA
45~60min
用的santacruz分装和整装的都可以。
效价一般1:
1000-1:
3000左右,可稳定较长一段时间。
蛋白来源肺脏
19kd,35kd
0.2pvdf
恒流250
大鼠血管
140kd
恒流,200mA
210min
湿转,北京六一
心肌
90kDa,70kDa,12.6kDa
NC
70v240min,120min,60min
脑
16KD60KD
16的用0.22的PVDF,60的用0.45的NC
20V
16的30min,60的90min
Bio-Rad半干
子宫内膜癌组织
156.8
恒流400mA
真核表达
〔多种,30个以上
40-200kD
恒压100V〔电流在280mA至350mA之间
60min〔M<
100kD,60-100min<
100kD<
M<
200kD>
大鼠肾脏
130kD
0.45NC膜PALL
湿转恒流350mA
120min
一抗用的sigma羊抗大鼠,0.2mL包装的,打折后价格3000多,有些贵哦。
比例调整到1:
1500左右条带可,用BSA封闭。
但是背景稍高。
38KDa
PVDF膜,
80v恒压
180min
约35kD〔双亚基
0.22umPVDF
恒流200mA
湿转Bio-rad,天能,六一
转膜时间其实不需要那么长的,转膜没转上一般原因不在这里,可能是转膜液的原因:
有些蛋白SDS可能影响其与膜的结合,还原型电泳因巯基乙醇的原因也可能导致后面的抗体不结合〔这是我最近的经验教训,还有一抗的选择很重要,一定要选识别线性表位的抗体,才能用于做WB。
细菌蛋白
全部的可溶性蛋白
11-170KD
湿转恒流300mA
骨肉瘤细胞
72kDa
PVDF膜<
0.45um>
半干转恒流200mA
20-30min
Bio-Rad型号忘了,就是有4个插孔的电泳仪。
建议改进方向:
低温很重要,新鲜的电转液也很重要。
骨肉瘤CELLLINE
Betaactin
42kDa
NitrocelluloseMembrane0.2umPoreSize<
Invitrogen>
湿转,恒压22v
X-cellSureLockMini-cell<
转膜过程冰水浴,保持低温,TransferBuffer重复使用。
肾瘤细胞
39kDa
湿转恒压100v
50min
MCF7
70kDa
PVDF膜〔GE
湿转100伏
伯乐小转膜仪
pichia分泌表达
细胞因子等
17到30kDa
milliporePVDF0.45um
这个条件除了100KDa的预染maker转的不好,剩下的条带都非常清晰。
正向前面ycwzq说的,感觉时间不是很重要,只要蛋白别太小或太大,在一个比较宽的时间和电压范围都能转上。
当然这些还有一个重要的影响因素就是所用的蛋白转印缓冲液。
所以建议把自己用的转印缓冲液的配方也贴上,便于分析交流。
我先说我的吧,是大师兄师姐的配方,我用了感觉还不错,但是100KDa以上的转的不好。
蛋白转印缓冲液pH8.2:
Tris碱1.93g,甘氨酸9g,甲醇200ml,加水定容至1000ml。
大鼠坐骨神经
30kDa
0.2um>
湿转恒流300mA
45min
小鼠胚胎成纤维
36KDa、55KDa
PVDF膜0.45
湿转Bio-Radmini
垫子变薄时,可用三层纤维垫,也没问题。
小鼠前列腺癌细胞
P53P21RAD51GAPDH
53KDa、21KDa、37KDa、36KDa
恒压110v
HEK293总蛋白
~200KD
PVDF膜0.2um<
用甲醇预先处理>
恒压25V
过夜<
~16-20hours>
bioradmini
人前列腺癌细胞
~40KD
WB用膜类型、孔径:
PVDF膜0.45um<
恒压20V,限制最高电流0.3A。
~16-20hours>
bioradsemi-dry
组织
蛋白名称〔可保密
42KDa
PVDF膜〔0.22
E.ColiBL21
4kd
恒压15v
O/N
Bio-RadMini湿转
转膜液的配制:
for1Ltransferbuffer,200mlMethanol,14.4gGlycine,3.03gTrizma-base。
用了Trcine-gelSDSPage,效果不错
肾脏
23kd
PVDF0.45um
恒压20v
35mins
Bio-Rad半干
来自MDCK增殖的流感病毒裂解物
PB1
96kd〔注意,10%SDS-PAGE,冰上电泳。
用预染marker观察100kd的条带跑到胶的
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