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Aspergillusniger;
glucoamylase;
fermentation
1.7前景展望………………………………………………………………………………………5
1.8本实验的研究目的与意义…………………………………………………………………….6
3.1.9不同(NH4)2SO4含量对产酶的影响……………………………………………31
3.2正交实验结果与讨论………………………………………………………………………35
第一章引言
糖化酶又称葡萄糖淀粉酶,是一种习惯上的名称,学名为α-1,4-葡萄糖水解酶。
它是一种一条肽链的酸性糖蛋水解酶,具有外切活力,能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物碳链上的1,4-糖苷键连接的非还原端,终产物是β-D-葡萄糖,也可水解α-1,6-糖苷酯和α-1,3-糖苷键,但相对水解速度较慢。
糖化酶是由曲霉优良菌种(Aspergilusniger)经深层发酵提炼而成。
葡萄糖淀粉酶是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类,因此广泛应用于酒精、淀粉糖、味精、抗菌素、柠檬酸、啤酒等工业以及白酒、黄酒,具有很高的商业价值。
1.1产糖化酶菌株分布
糖化酶广泛地存在于微生物中。
已报道的产糖化酶菌株中真菌有23个属35个种,它们分别是:
雪白根霉(Rhizopustonginensis)、德氏根霉(R.delemar)、河内根霉(R.tonkenisis)、爪哇根霉(R.ja-vanic)、台湾根霉(R.formosaensis)、臭曲霉(A.spe.rgfllusfoetJdus)、黑曲霉(A.niger)、海枣曲霉(A.pHenicis)、宇佐美曲霉(A.usamii)、红曲霉(Monascussp)、扣囊拟内孢霉或肋状拟内孢霉(Endomycopsisfibu-liger)、泡盛曲霉(A.awamori)等。
某些细菌中也可以分离到热稳定的糖化酶,如S.diastaticus、Arthrobucterglobifor、Flavobacteriumsp、Clostridiumthermohy等。
此外,人的唾液与动物的胰腺中也含有糖化酶。
工业上生产糖化酶的菌种主要是黑曲霉(Aspergillusniger)和根霉(Rhizopus),通过固体培养法和液体深层培养法生产糖化酶。
各国使用的产糖化酶菌株有所不同,我国主要使用根霉、黑曲霉及其变异株;
用泡盛曲霉及其变异株的国家有俄罗斯、保加利亚、加拿大;
有的国家用红冬酵母(FERM-P6948)、双孢拟内孢霉、裂褶菌(Shizopbyllumcommune)生产糖化酶。
其中黑曲霉AS3.4309是产生糖化酶的典型菌株。
该菌株适宜低温生长,培养最适温度为32℃。
它生长缓慢,茵丝纤细,分生孢子柄短。
在制曲时,前期茵体生缓慢,结块疏松,当出现分生孢子时即迅速蔓延。
假如曲室温度高,相对湿度大,品温达37℃以上时,容易出现“烧心”和长“水毛”现象,即麸曲表面有纤细长绒状菌丝,有凝结水,曲心灰黑色,结块紧密。
这便容易招致麸曲糖化力的急剧下降。
因此,制曲时要确保种曲干燥,减少杂茵污染。
并要控制前、中期温度,保持品温不超过32℃,同时注意在形成孢子之前便要出曲。
1.2糖化酶的结构和作用机制
1.2.1糖化酶结构和多型性
糖化酶是一种含甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白。
它的分子量为60000~100000。
糖化酶是糖苷水解酶的一种,它一般由催化域(catalyticdomain,CD)、淀粉结合域(Starch-bindingdomain,SBD)及连接CD与SBD的O-糖基化连接域(O-glycosylatedlinkerdomain)组成。
黑曲霉、泡盛曲霉和子囊菌酵母糖化酶的催化域构型类似,都有12股α-螺旋参与折叠成“桶状”结构。
JSaucer等(2000)研究认为,黑曲霉糖化酶水解糖苷键的机制是典型的酸碱催化。
淀粉结合域对糖化酶的功能有很大影响,如果缺失会让水解非水溶性底物的速度
明显降低,而降解水溶性底物的速度不变。
SBD上有两个结合位点,可以结合两分子的底物。
SBD扭转了淀粉链的方向,使更多底物向催化域中心靠近。
糖化酶的连接域(Linkdomain)起连接CD与SBD的作用,连接域一般被O-糖基化修饰。
糖化酶具有多型性,如Rhizopusnivenus可以产生5种活性成分[7],KOne等(1988)从糖化酶A.niger当中分离出6种活性成分,这6种成分的相对分子质量、沉降系数、化学组成、等电点、酶的动力学和其他性质上各异。
TTomoko(1982)认为,RhizopusSP的多型糖化酶之间的差别是翻译后修饰的结果,即分子量较小的糖化酶是分子量较大的糖化酶被蛋白酶作用后的修饰产物。
DAlazard(1978)认为,糖化酶的多型性主要是由基因调控、转录水平不同,蛋白质合成修饰作用不同引起,而培养基的成分和生长条件对糖化酶组分的多型性也有影响。
1.2.2作用机制
糖化酶作用于淀粉、糊精、糖原分子的非还原型末端,依次切开α-1,4糖苷键,生成葡萄糖。
糖化酶底物专一性较低,除了能从非还原性末端断裂α-1,4糖苷键外,也能水解α-1,6糖苷键和α-1,3糖苷键,但是相对水解速度较慢,水解α-1,6糖苷键的比速率仅为α-1,4糖苷键的0.2%。
它们也能作用于支链淀粉的α-1,6键,但是速度也很慢,因此分解产物都是葡萄糖。
糖化酶对淀粉的分解能力与酶活力、吸附性、解支能力、原料的性质、温度、pH等糖化工艺条件有关。
底物的水解速率主要受底物分子的大小及结构的影响,同时也受水解碳链序列中下一个键的影响。
其底物亲和性与底物的碳链长度呈线性关系,碳链越长底物亲和力就越大;
糖化酶所水解的底物分子越大其水解速度就越快,而且酶的水解速度还受到底物分子排列上的下一个键影响,邻近α-1,4链的α-1,6糖苷键较独立的α-1,6链更易被打开。
1.3糖化酶的基因研究
在糖化酶结构基因与调控序列方面,AToshihiko等(1988)构建了水解生淀粉的黑根霉糖化酶基因的物理图谱。
EBoel等(1984)从黑曲霉的染色体文库中分离出糖化酶的基因,其含有5个内含子,而泡盛曲霉中含有4个内含子。
20世纪80年代中期以来,国外开始有构建分解淀粉酵母菌的报道,先后有米曲霉、根霉、泡盛曲霉、黑曲霉、扣囊拟内孢霉、米根霉、糖化酵母等微生物的糖化酶基因在酿酒酵母中得到表达。
LLin等(1998)将泡盛曲霉糖化酶基因通过整合转入酵母的染色体中,获得了该糖化酶基因在酿酒酵母中的表达。
RJSwif(t1998)对携带有20个糖化酶基因拷贝的重组菌A.nigerB1进行了糖化酶发酵研究,在其最大生长速率时糖化酶的产量达到15.0mgGAM/h。
LRyszka(2002)对整合了多拷贝糖化酶基因的重组菌进行了糖化酶发酵研究。
对于液态发酵,重组菌A.awamoriA.a.2/2和A.nigerA.n.20糖化酶活力是出发菌株的两倍,对于固态发酵,重组菌A.awamoriA.a.14的糖化酶活力比出发菌株提高了85%。
1.4糖化酶的处理
糖化酶的提取分为预处理、固液分离、液体浓缩、酶的干燥沉淀4个步骤。
常用的无机絮凝剂有硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等,有机絮凝剂有聚苯乙烯磺酸、囊丙烯酸(或钠盐)、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺等。
用高分子聚合物(如右旋糖酐、聚乙二醇、聚丙烯酸等,沉淀酶也是有工业价值的方法。
糖化酶的发酵液大多以板框压滤机进行压滤。
此外,离心机也可以应用于固液分离。
糖化
酶的浓缩方式已从过去的蒸发浓缩发展到超滤浓缩。
目前采用的超滤装置有搅拌式、浅道式系统、套简膜式以及中空纤维。
超滤浓缩回收率都在95%左右。
杜学敏等(1996)利用PEG/(NH4)2S04双水相系统从粗酶液中提取糖化酶。
在提取的最佳条件下,糖化酶回收率最高为98.81%。
由于糖化酶中的葡萄糖苷转移酶严重影响葡萄糖回收率,于是许多学者进行了除去葡萄糖苷转移酶的研究。
林维宣等(1996)研究了磷钨酸、十二烷基磺酸钠、单宁酸3种试剂除去糖化酶中转酶的方法,使糖化酶活力基本不变;
单宁酸
法转苷酶去除率为3%,糖化酶活力提高9.8%。
近年来,酶制剂工业上大多生产液体酶,免去了固体酶制剂需溶解活化的工序。
但是,液体酶极易失活。
因此,在液体酶中添加合适的稳定剂是常用的方法。
国内外多采用添加一些中性盐、亲水性胶体、多元醇稳定剂的方法。
薛正莲等(2002)利用黄原胶分子结构上有大量的亲水和疏水基团,在水溶液中可以形成网状结构和热稳定性好等特性,将它应用于糖化酶的稳定性保护,结果于室温条件下保存6个月,酶活损失比对照减少了24.6%。
张贺迎(2002)则在液体糖化酶制剂中加入了黄原胶、明胶、甘油、氯化钠、硝酸钠、磷酸氢二钠组成的复合稳定剂,在30℃左右的室温条件下保存2个月,酶活保存率达到89.6%。
马林(1992)用带有疏水基团的疏水性多糖方便有效地稳定糖化酶,明显地提高了糖化酶的贮存稳定性。
1.5糖化酶的固定
糖化酶作为一种生物催化剂,其重复利用性能与稳定性一直是国内外研究的热点之一,固定化就是稳定化处理方法之一。
固定化酶具有可以使酶的可逆和不可逆热失活及由变性剂引起的可逆性伸展,或使寡聚酶离解成无活性亚基等过程
降低,并可以反复连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点。
将糖化酶固定化的方法主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等。
HHWee-talt等(1972)最初用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷,然后硅烷化,最后用重氨基醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶。
结果表明其酶活较高,45℃条件下能连续生产3个酶半衰期,使用时间也较长。
WLStanley(1978)用戊二醛固定糖化酶,活力为游离酶的67%。
SSCeleb(1991)等用硅藻土吸附糖化酶。
一些含有离子交换基团的固相载体如DEAE—纤维素、DEAE—交联葡聚糖、离子交换树脂等也可吸附糖化酶。
国内学者曲红波等(1998)与邱广亮等(1997)用两亲性的聚乙二醇胶体粒子、Al2O3、多孔聚酯材料等也取得了良好的效果。
随着膜技术的发展,超滤膜开始应用于固定化,国外学者DDarnoko(1989)和KASims(1992)用膜反应器取得了良好的效果。
近年来,对糖化酶固定化的研究主要集中于选择与修饰载体,以提高酶偶联量和相对活力、动力学研究等,但是限于工艺、成本等因素,固定化糖化酶尚未实现工业化生产。
1.6糖化酶在食品生产中的应用
糖化酶的应用范围日益扩大,特别是在食品生产行业中得到了广泛的应用。
我国传统酿酒生产大多使用淀粉质原料,以曲为糖化剂,采用固态发酵法,但成本高,出酒率低。
糖化酶的应用使粮醅入酵后发酵升温快,幅度大,提高原料的出酒率,缩短发酵周期。
覃雪珍在湘泉浓香型白酒的混蒸混烧工艺中添加TTAADY和糖化酶,结果发现有助于提高己酸乙酯的含量,抑制乙酸乙酯的生成,取得了产量与质量的双赢。
彭燕则在混蒸混烧工艺中添加糖化酶,在转型时可以明显缩短转型期,在生产中可以使酒醅发酵更彻底、更充分,提高出酒率。
王卫国(1996)则将糖化酶在黄酒生产上的应用做了研究,他通过正交实验对糖化酶在黄酒酿造中的影响因素进行了研究,出酒率高达92.06%,感官鉴定也得到了优。
传统小曲酒的生产,通常是以传统小曲作为糖化剂,采用先培菌糖化后发酵工艺,有学者用糖化酶代替部分小曲作为发酵剂,同时对培菌糖化的时间、温度、用曲量进行了研究,对提高淀粉的利用率和小曲的产量均有增长。
在啤酒生产上可以应用糖化酶,采用多温度段糖化工艺,提高了麦汁可发酵糖的比例,制成了风味独特的干啤酒。
在食用醋生产中,应用糖化酶可以解决企业自制酒母质量不稳定和夏季高温等生产难题,使食用醋生产正常进行。
采用α-淀粉酶对冷冻食品中的淀粉进行水解后,再用糖化酶糖化生成葡萄糖。
可以防止淀粉老化返生,消除淀粉味感,改善了冷冻食品的品质。
糖化酶在天然产物提取中也有一定的作用。
因为皂素在植物中大多以糖苷的形式存在,游离的甙元极少,为了提高皂素的收率,可以在酸水解之前先对黄姜原料进行酶解,这样既可以减少酸用量,又能明显地提高皂素的收获率与质量。
山药汁容易沉淀并有令人难以接受的臭味。
针对这个问题有研究人员将山药干片先用水提取,然后再用酶水解,应用此工艺加工出来的山药汁,沉淀少、无臭味,并且酶用量少、酶解时间短。
1.7前景展望
虽然糖化酶的研究已经进行了多年,但是依然存在许多问题等待解决,糖化酶的研究方向将集中在以下几个方面。
(1)将精确的分子生物学技术应用于菌株选育中,进一步提高酶活力,筛选耐热糖化酶产生菌或者克隆糖化酶耐热基因或者选育出适于常温糖化的菌株以降低生产成本。
(2)深入研究糖化酶的酶学特性,进一步深入了解糖化酶的结构,探明糖化酶热稳定性机理,提高糖化酶基因的表达水平。
(3)利用各种酶的特性改良技术,包括酶分子修饰技术、酶的非水相催化技术等,这些技术对酶的优化生产和高效应用起到促进作用。
(4)进一步优化糖化酶提取精制工艺,采用先进的提取工艺和设备使糖化酶既是高纯度、高活力的产品,又符合卫生标准。
采取恰当的措施,延长糖化酶的保存时间。
(5)继续发展糖化酶的固定化技术,努力提高单位载体的固化酶活性容量,提高其使用寿命,扩大其使用范围。
随着科技的进一步发展和研究的深入,糖化酶一定会发挥更大的作用,并且更好地造福人类。
1.8本实验的研究目的与意义
研究黑曲霉AS3.4309菌株发酵产酶条件,对培养成分和发酵条件进行优化。
确定最佳培养基配方和发酵条件,进一步提高菌株的产酶活力。
第二章实验材料和方法
2.1实验材料与仪器
2.1.1实验仪器
表2-1实验仪器
仪器
型号
生产厂家
电热压力蒸汽灭菌锅
LDZX-40SBI
上海申安医疗器械厂
恒温振荡培养箱
HZQ-Q
东联电子有限公司
生化培养箱
HPS-160
哈尔滨东明仪器厂
超净工作台
SW-CJ-IF
杭州净化设备公司
电子分析天平
FC204
上海精密仪器厂
pH测量仪
PHSJ-4A
水浴锅
HH.SYZ1-N
北京长风仪器有限公司
微波炉
LG
韩国LG公司
远红外快速恒温烘干箱
YHG-50X55
上海跃进医疗器械厂
备注:
除以上仪器,本实验还用到纱布、量筒、比色管、碘量管等常规仪器。
2.1.2实验材料
①主要药品:
表2-2实验主要药品
药品名称
纯度
蔗糖
A.R.
天津凯通化学试剂有限公司
NaNO3
青岛化学试剂厂
琼脂粉
B.R.
北京奥博星生物技术有限责任公司
蛋白胨
碳酸钠
上海联试化工试剂有限公司
葡萄糖
上海化学试剂分装厂
可溶性淀粉
天津风船化学试剂科技有限公司
硫酸铵
莱阳经济技术开发区精细化工厂
氯化钠
莱阳市康德化工有限公司
95%酒精
新泰市金滕医药酒精有限公司
75%酒精
浓硫酸
氢氧化钠
天津博迪化工有限公司
硫代硫酸钠
中国联试化工试剂有限公司
冰醋酸
硫酸亚铁
氯化钾
C.P.
金山县化工厂
磷酸二氢钾
乙酸钠
无水硫酸镁
碘化钾
天津市风船化学试剂科技有限公司
碘
③培养基:
(1)PDA琼脂培养基:
马铃薯200g,蔗糖20g,琼脂20g,蒸馏水1000ml,121℃高压灭菌20min,备用。
(2)察氏培养基(摇瓶发酵培养基):
蔗糖30g,NaNO33g,K2HPO41g,MgSO4·
7H2O0.5g,KCl0.5g,FeSO40.01g,蒸馏水1000ml,121℃灭菌20min,备用。
(3)摇瓶发酵培养基:
:
玉米粉12%,豆粕粉4%,麸皮5%,玉米浆1%,(NH4)2SO40.3%,pH4.0~4.5,121℃灭菌20min,备用。
④试剂:
(1)20g/L可溶性淀粉溶液(使用当天配置):
准确称取20.000淀粉(100-105℃烘干至恒重1-2h),用少量水调匀,再搅拌下加入约500ml沸水,继续加热煮沸至透明(约20min),冷却后用水定容1000ml。
(2)pH值4.6的乙酸-乙酸钠:
称取8.204g无水醋酸钠,先在少量水中溶解,定容至1000mL。
取分析纯冰醋酸5.78mL定容至1000mL。
以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25:
22混合即为所需求之缓冲液,校正PH值。
(3)5mol/L氢氧化钠:
称取NaOH100g溶解并用蒸馏水定容至1000ml。
(4)0.1mol/L碘标准滴定溶液:
称取36g碘化钾溶于50ml水中,在不断搅拌下加入13g碘,完全溶解后定容1000ml,贮存在棕色瓶中,密闭、避光保存。
(5)0.1mol/L氢氧化钠:
称取4g氢氧化钠溶解定容至1000ml。
(6)2mol/L硫酸溶液:
量取浓硫酸(相对浓度1.84)5.6ml,缓缓加入80ml水中,冷却后定容100ml。
(7)0.05mol/L硫代硫酸钠标准滴定溶液:
称取12.5gNa2S2O3·
5H2O和0.1g无水碳酸钠,溶于刚煮沸冷却后的蒸馏水中,并用该水定容至1000ml,贮存棕色瓶子中,3天后标定再用。
(8)淀粉指示剂(临用前现配):
0.5g可溶性淀粉于100ml的烧杯中,少量水调成糊状,倒入70ml沸水,继续煮沸2min,冷却后定容100ml。
④菌种:
黑曲霉AS3.4309是实验冰箱存有的。
2.2实验方法
2.2.1菌株的活化
从冰箱中取出现有的菌株,转接试管斜面活化,在30℃下恒温培养3-4天.
2.2.2液体种子的制备
取活化后的菌株孢子2-3环接种在察氏培养基上,在30℃,200r/min的恒温振荡培养箱中培养。
2.2.3产酶条件优化
(1)黑曲霉糖化酶活力变化测定:
将黑曲霉接种于装有50mL摇瓶发酵培养基的500mL三角瓶中,30℃、200r/min振荡培养,每隔1d取样测定
(2)不同种龄对产酶的影响:
将装有100mL察氏培养基的300mL三角瓶中,30℃,200r/min振荡培养,选择培养32h、36h、40h、44h、48h的一定量的液体种子转入到500mL发酵培养基培养,以最优酶活时间培养,测其酶活。
(3)不同装液量对产酶的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中分别装有50mL、60mL、80mL、100mL的发酵培养基,30℃、200r/min,以最优酶活时间培养,测其酶活。
(4)不同初始pH值对产酶的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中,采用最优装液量,选择5个不同的pH值,分别是2.0、、4.5、5.0、6.0,30℃,200r/min以最优时间培养,测其酶活。
(5)不同玉米粉含量对产酶的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中,采用最优装液量和最优pH值,选择玉米粉质量分数分别是6%、9%、12%、15%、18%,30℃,200r/min以最优时间培养,测其酶活。
(6)不同豆粕粉含量对产酶的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中加入最优玉米粉量,其他成分不变,采用最优装液量和最优pH值,选择豆粕粉质量分数分别是0、2%、4%、6%、8%,30℃,200r/min以最优时间培养,测其酶活。
(7)不同玉米浆的含量对产酶的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中加入最优玉米粉量和玉米粉量,其他成分不变,采用最优装液量和最优pH值,选择玉米浆质量分数分别是0、1%、3%、5%,7%,30℃,200r/min以最优时间培养,测其酶活。
(8)不同麸皮含量对产酶的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中加入最优玉米粉量、玉米浆量和玉米粉量,其他成分不变,采用最优装液量和最优pH值,选择麸皮质量分数分别是0、1%、3%、5%、7%,30℃,200r/min以最优时间培养,测其酶活。
(9)不同(NH4)2SO4含量对产酶的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中加入最优玉米粉量、麸皮量、玉米浆量和玉米粉量,其他成分不变,采用最优装液量和最优pH值,选择(NH4)2SO4质量分数分别是0、0.15%、3%、0.45%,30℃,200r/min以最优时间培养,测其酶活。
(10)不同水浴温度对酶活的影响:
将最佳种龄的液体种子接种在500mL的三角瓶中,采用最优装液量和最优pH值,30℃,200r/min以最优时间培养,在水浴锅40℃、45℃、50℃、55℃、60℃下测其酶活。
(11)玉米粉、玉米浆、麸皮、装液量正交实验设计:
在单因素实验的基础上,选择影响发酵培养产酶的4个主要因素:
装液量、(NH4)2SO4含量、玉米浆含量及麸皮含量,进行L9(34)组合正交实验。
2.2.5糖化酶活力测定
(1)测定原理:
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,水解α-1,4-葡萄糖苷键,也能缓慢切开α-1,6-葡萄糖
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