分子诊断学分子诊断学参考Word格式文档下载.docx
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细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和
基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分布和排列
4.C值:
基因组的大小又称C值,常用碱基数目或碱基对数目来描述
①C值是特异的,物种不同,差异极大,真核生物中,一般随着进化,C值增大
②C值矛盾:
又称C值悖论,生物的进化程度与基因组大小不完全成比例的现象
5.真核生物基因组
1)基本特征:
①有细胞核基因组和细胞器基因组之分;
②核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上;
③基因多数为断裂基因,有内含子结构和大量重复序列;
④单顺反子,基因家族;
⑤核基因组由染色体DNA组成,分子量较大,结构复杂,与蛋白质结合。
注意点:
①染色质的基本组成单位是核小体,由组蛋白核心和周围的DNA组成。
组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2个分子组成核心即组蛋白八聚体②一个基因有n个内含子,则相应有n+1个外显子③重复序列分为4类:
单一序列、轻度重复序列(2—10个拷贝)、中度重复序列(10—12个拷贝)、高度重复序列(1万以上)④多基因家族:
一些有编码功能的重复序列,即指起源相同,序列相似,功能相关的的一组基因,分为基因簇(相对集中分布在某一染色体的特定区域)和另一类基因家族成员在整个染色体上散在分布,甚至位于不同染色体⑤超基因家族:
由基因家族和单基因组成的较大的基因家族,结构不等的同源性,功能不一定相同⑥假基因:
基因家族中有的成员因突变而失活,不能表达出有活性的产物。
6、人类基因组计划(HGP):
旨在测出人类基因组30亿碱基对的核苷酸序列,发现所有人类基因并确定它们在染色体上的位置,破译人类全部遗传信息,发展基因组学新技术,探讨人类基因组研究的社会法律与伦理等问题的一个国际性研究项目。
1)主要任务:
人类的DNA测序,包括序列图谱、遗传图谱、物理图谱、转录图谱等的绘制2)测序策略:
经典的逐步克隆法、全基因组鸟枪法3)人类基因组概貌:
①GC含量:
平均41%(33%—65%)②CpG岛:
即二核苷酸CG③染色体的重组率④基因突变率:
男性多见⑤重组序列的含量,包括SINE、LINE、LTR、卫星DNA、Tn等⑥单核苷酸多态性(SNP)含量⑦基因数量:
2、6万—3、9万个⑧蛋白质数量:
选择性剪接较多,使得蛋白质多而复杂⑨疾病基因⑩人基因组序列:
99、99%相同4)人类基因组多样性:
同一人种或不同人种基因组存在或多或少的差异。
通常DNA分子中某一特定位点的变异频率低于1%为基因突变,高于1%为DNA分子多肽。
人类DNA分子多肽性的产生有以下几种主要方式:
①重复序列单元的拷贝数变异,如微卫星DNA多态性②转座因子导致的分子多肽,如Alu序列多态性③单个核苷酸的变异即SNP
7、原核生物基因组
1)一般特点:
①基因组相对较小,通常为一条双链DNA分子
②功能相关的基因高度集中,构成操纵子
③重复序列少,大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式,而RNA基因常是多拷贝
④没有内含子,基因是连续的⑤多顺反子,构成转录单位
⑥绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的,只有很少不编码序列
⑦DNA分子中有各种功能区;
多顺反子(polycistron):
操纵子中常常有一至多个功能相关的结构基因串连一起,受同一个调控区调控,转录在同一个mRNA分子中。
8、质粒是多数细菌和某些真核生物细胞的染色体外的双链环状DNA分子
1)遗传特性:
①双链环状DNA分子,且为共价闭合环状DNA(cccDNA)②质粒复制有赖于宿主细胞的复制,但其自身基因可控制合成的时限及拷贝数③垂直传递④不影响宿主细胞代谢,但可能赋予宿主细胞新的表型⑤治理的复制方式为半保留复制。
单向/双向,单向,双向。
2)特性:
①质粒的不相溶性:
两种不同质粒如果利用同一复制和维持机制,会在复制和随后向子代细胞分配的过程中相互竞争,因而不能在同一宿主细胞内稳定存在,其中一种质粒将被丢失的现象。
这两种质粒属于同一不相容群(InC)。
②质粒的稳定性:
质粒在宿主细胞内能稳定存在不被丢失称为质粒的稳定性。
③质粒的转移性。
④质粒的选择性标记。
3)①质粒的拷贝数:
在正常生长条件下,每个宿主细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。
由其携带的复制子决定。
②复制子是一个复制单位,包括复制起点及其相关的调控元件。
③质粒的复制由复制子与调节因子协同作用来启动。
4)松弛型质粒:
以RNA为调节因子的质粒的复制不需任何自身编码的蛋白质,完全由宿主细胞提供的寿命较长的酶及其他蛋白质因子来完成,这些质粒的复制不受宿主细胞的控制,以所谓的“松弛”方式进行。
属高拷贝质粒。
严紧型质粒:
携带与蛋白质调节因子相互作用的复制子的质粒。
属低拷贝质粒。
9.转座因子:
又称可转座元件,指能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列。
1)①转座现象或移位:
指由可移动因子介导的遗传物质重排现象。
②转座作用结果:
a.导致宿主细胞基因组DNA的插入突变或基因重排,是毗邻基因失活或表达水平下降。
b.转座因子被认为是基因组进化的重要推动力量,还可作为遗传学研究及基因工程的工具。
2)原核生物转座因子的种类:
插入序列(IS)、转座子(Tn)、可转移性噬菌体。
①IS:
a.IS两端有正向重复序列(DR)和反向重复序列(IR);
b.IR结构的对称使IS既可正向插入靶位点,也可反向插入靶位点;
c.IS的中间位编码序列,仅编码与转座有关的酶,含有依赖p因子的转录终止信号及终止密码,从而导致插入位点的基因失活或表达水平下降。
②Tn:
基因组中存在的能自主复制和位移的一些DNA序列。
特点:
a.两端有反向重复序列;
b.转座后靶位点重复序列是正向重复序列;
c.编码与转座有关的蛋白;
d.可以在基因组中移动。
3)转座类型:
复制型转座、非复制型转座。
复制型转座:
转座因子在转座过程中能够复制,结果是供体与受体都有一个拷贝的转座因子。
需转座酶和解离酶。
非复制型转座:
转座因子不复制,直接从一个位点移到另一个位点,结果是供体失去一个转座因子而受体得到一个转座因子。
需转座酶。
10.病毒基因组:
1>
①只有一种核酸,4种类型,为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA
②核酸大小差别较大(1.3×
103bp~3.6×
106bp)
③具有启动子和操纵子结构
④具有重叠结构
2>
结构:
①帽子和poly(A)尾结构,对RNA起保护作用,并于病毒感染性有关
②黏性末端:
基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分
③末端正向重复序列:
又称末端冗余,指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸
④末端反向重复序列(ITR):
指病毒基因组两端的反向互补重复序列
⑤重叠基因:
指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列
⑥分段基因:
指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成,多冗于tDNA病毒,RNA、病毒及双链RNA病毒⑦CTR:
即长末端重复序列,逆转录病毒逆转录后生产的dsDNA中,两端有CTR结构
11.核酸分子杂交基本原理:
利用核酸变性和复性的性质,使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。
(分子杂交可以发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间,也可在RNA链与DNA链之间形成)
12.核酸变性(denaturation):
指维系核酸双链互补碱基对之间的氢链断裂变成单链的过程,并不涉及共价键的断裂。
(黏度减小,浮力密度增大,260nm处紫外吸收增加,活性降低)(热变形,酸碱变性,化学变性)
Tm(meltingtemperature):
通常把热变性过程中DNA变性一半所需要的温度成为融解温度。
DNA的Tm值在82~95℃之间
Tm影响因素:
DNA的均一性,碱基组成,溶液的离子强度,pH,变性剂
13.DNA复性(renaturation):
当变性条件缓慢去除后,两条彼此分开的互补单链重新缔合成双螺旋结构的过程。
(许多理化性质恢复,但热变性后骤然冷却,DNA则不可复性)
①退火(annealing):
热变性后,将温度缓慢降低而使DNA逐渐冷却即可复性的过程。
②复性过程分两步:
成核作用(nucleation)和拉链作用(zippering)
成核作用:
两条核酸单链随机碰撞形成暂时局部双链,如果局部双链周围碱基不能配对,则迅速解离,重新碰撞直到找到正确的互补序列,这个过程称为成核作用。
拉链作用:
在成核的基础上,两条单链的其余部分碱基迅速互补配对,就像拉链那样形成完整的双链分子。
③复性速度用Cot1/2衡量,Co:
单链DNA的起始浓度(mol/L),t为时间(s),Cot1/2表示单链DNA的起始浓度与复性一半所需时间之和,与复性速度成反比,与DNA复杂度有关
影响因素:
DNA的分子大小和复杂度,离子强度,DNA的浓度,温度
14.探针(probe):
广义上指的是能特异性与特定靶分子发生相互作用,并能被某些方法所检测的分子
核酸探针:
指能与特定靶基因序列发生特异性互补结合,并可用特殊方法检测的被标记的已知核酸序列
15.核酸探针的种类:
基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针
1)基因组DNA探针:
①制备方法:
a.分子克隆b.采用聚合酶链反应扩增特定的基因组DNA片段②优点:
制备方法简便、省时、易得,稳定不易降解,标记方法多样也较成熟
2)cDNA探针:
①cDNA(complementaryDNA):
指与mRNA互补的DNA分子,它是以mRNA为模板,遵循碱基互补配对原则,由逆转录酶催化合成②优点:
基因组DNA优点,不存在内含子和其他高度重复序列,尤其适用于基因表达研究(但制备困难)
3)RNA探针:
杂交效率高,杂交分子稳定,不存在高度重复序列,非特异性杂交较少,不易标记,易降解
4)寡核苷酸探针:
①特点:
a.根据实验需要合成b.长度一般为20~50ntc.可以识别靶分子的单个碱基变化d.特异性不高,杂交信号不强②设计原则:
a.探针长度一般20~50ntb.剪辑成分,Gtc含量在40%~60%为宜c.不应存在大于4bp的互补序列d.避免同一碱基重复出现多于4次e.同源性不应超过70%或有连续8个上碱基同源
16核酸探针的标记,两大类
1)放射性核素:
最常用,灵敏度和特异性极高,但半衰期短,检测时间长,污染环境
非放射性核素:
稳定、安全、经济、检测时间短,但灵敏度
2)理想标记物:
①高灵敏度②标记物与探针结合后,不影响碱基对的特异性,杂交体的稳定性及其Tm值。
③检测方法应高灵敏度、特异、假阳性率低④标记物与探针结合后稳定,保存时间长⑤标记物对环境无污染、对人体无损伤、价格低廉。
17放射性核素的标记常用PSH
1)类型特点:
125I131I
①32P:
比放射活性3.4×
1014Bg/mmol.最常用。
放射性强,释放的β粒子能量高,穿透能力强,灵敏度高,半衰期仅14.4d,射线散射严重而影像分辨率,影响结果分析。
②35S:
比放射活性5.55×
1013Bg/mmol.释放的β粒子较32P稍低,半衰期87.1d,灵敏度比32P低,散射作用弱,分辨率较高,适用于原位杂交。
③H:
比放射活性1.07×
10Bg/mmol,释放的β粒子能量较低,半衰期12.1年,采用延长曝光时间的方法可产生本底低,分辨率高的结果,金庸与细胞原位杂交,可反复使用,对环境影响大。
④I、I:
释放β粒子和γ射线,具有较高敏感性,较强分辨率,危害性大。
2)标记法:
采用体外标记法,包括化学法和酶法
化学法:
利用标记物分子和探针分子上活性基团间的化学反应,将标记物结合到探针分子的标记方法。
酶法:
预先将标记物标记在核苷酸分子上,经过酶促反应将标记号的核苷酸分子或标记基因掺入或交换到探针分子中的方法,有切口平移法,随机引物法,末端标记法,PCR标记法。
①切口平移法:
DNaseIMg随机切割3’—OH引物EcoliDNA聚合酶IdNTP切除5’端的核苷酸合成互补单链
②随机引物法:
随机引物是人工合成的由6个核苷酸残基构成的寡核苷酸片断的混合物。
Klenow酶
③末端标记法:
1)3’端标记法:
限制性内切酶、klenow酶2)5’端标记法;
T4噬菌体多核苷酸激酶(PNK)标记法、碱性磷性磷酸酶(ALP)切除5’端的磷酸基团PNK作用转移
18.非放射性核素标记:
生物素、地高辛、光敏生物素、荧光素、酶标法(ALPHRP)
19.核酸探针的检测:
放射性:
①放射自显影②液体闪烁计数法
非放射性:
偶联反应、显色反应(酶促显色法、荧光法、化学发光法)
20.核酸分子杂交的类型:
固相杂交和液相杂交两大类
1)①液相杂交:
将待测核酸样品和核酸探针同时放入杂交液中进行反应,然后分离杂交分子和过量的未杂交探针,再对杂交结果进行检测
②固相杂交:
预先将待测的靶核酸链固定在固相支持物上,然后与溶解于杂交液中的核酸探针进行杂交反应,洗去支持物上未参加反应的游离核酸探针,再检测杂交信号,分析结果。
2)常用固相杂交:
SouthernEP迹杂交NorthernEP迹杂交、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、原位杂交
3)SouthernEP迹杂交:
指经凝胶电泳分离的待测DNA片断转印并结合到一定固相支持物,然后用标记的探针DNA分子检测靶DNA的一种方法。
基本过程:
限制性核酸内切酶消化待测DNA→琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断→DNA变性并转印到固相支持物上→预杂交→与特异DNA探针杂交→杂交信号检测及结果分析
常用固相支持物:
尼龙膜、硝酸纤维素膜。
(1)Northern印记杂交:
指待测RNA(主要是mRNA)从凝胶转印到固相支持物上,与标化的DNA探针进行杂交的印迹技术。
与Sowthern印迹杂交不同点:
a.RNA易被环境中存在的RNA酶降解,应避免RNA酶污染b.RNA需要在变性剂存在下进行电泳,保持其单链状态,防止RNA分子形成二级结构,不能用碱变性c.印迹前将含有变性剂的凝胶用水浸泡除去。
21.聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)技术是指生物技术领域中最重要的四项技术之一(细胞融合技术,分子克隆技术,蛋白工程技术,基因扩增技术)特异,敏感,高效,简便,重复性,移易化等优点。
22.PCR的原理:
模拟体内DNA半保留复制过程,通过变性,退火,延伸,三步反应的循环完成,靶基因的双链DNA通过变性解链为单链,特异的引物通过退火与单链DNA模版结合,在靶DNA的指导下引物的3’端延伸靶DNA的互补链完成一个循环,理论上每次循环结束后靶DNA扩增一倍,即靶DNA数目以2ⁿ几何级数方法。
(1)反应体系:
模版DNA,四种dNTP,引物,TaqDNA聚合酶、缓冲液(含Mg2+)
(2)变性(denaturation):
模版DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模版DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链。
退火(annealling):
将下降至适宜温度(一般较Tm低5℃)引物与变性的DNA单链在碱基互补的基础上形成引物,模版杂交双链。
延伸(exension):
将温度上升至在70℃左右时,TapDNA聚合酶催化以引物为起点的从5’—3’端DNA链延伸反应,随着4种dNTP的掺入,合成新的DNA互补链。
(3)动力学:
y=A(1=R)ⁿ估算PCR产量,A为起始模板量,R为扩增效率
23.扩增产物的检测与分析
(1)凝胶电泳:
琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳。
(2)PCR产物的酶切技术:
PCR限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)
(3)PCR单链构象多态性分析PCR-SSCP
(4)核酸探针杂交分析
(5)PCR-酶联免疫吸附法
(6)PCR产物测序
25.PCR衍生技术:
巢式PCR,逆转录PCR,多重PCR,锚定PCR,反向PCR,免疫PCR,原位PCR,定量PCR(QPCR)
26.荧光定量PCR技术:
(1)基本原理:
基于荧光能量传递技术,通过对PCR扩增反应每个循环结束时产物荧光信号的检测,对起始模版进行定量分析。
2)实时荧光定量(realtimeFQ-PCR):
在荧光定量PCR反应中,引物的荧光化学物质,在每经过一个循环后,产生一个荧光强度信号,利用荧光信号累积及荧光强度变化实现对整个PCR过程实现监测。
荧光阈值:
设定在荧光扩增曲线上处于荧光信号指数扩增阶段是的任意一个值,一般荧光阈值设置在3-15个循环内Ct值:
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数,与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系
3)荧光定量PCR技术:
荧光染料法和荧光探针法
常用染料:
SYBBGreenI
探针法:
TaqMan技术,lightCycler探针技术,分子信标技术,复合探针法
(各法原理图见P86-88P90表5-4不同核酸扩增技术比较)
27.实验区分为四个独立的工作区域:
试剂贮存和准备区,标本制备区,扩增区,扩增产物分析区
四个基本原则:
1.四个区域必须是相互独立的,2.各区的仪器设备及物品必须是专用的,3.各区不能直通,应没有缓冲间,4.产物分析区产安装排风扇或其他抽风装置
十六字口诀:
各区独立,注意风向,因地制宜,方便工作。
还应设立临床标本接收区
28.室内质量控制(IQC)室外质量控制(EQC)
IQC:
包括测定前的质量控制,统计学质量控制,质量控制的评价等
29.DNA序列测定:
即DNA一级结构的测定,指用人工的方法测定并分析核酸的碱基组成及排列顺序。
它是研究基因结构,功能及其关系的前提,是临床疾病的分子诊断最为精确的判定依据
四种常用方法:
Sanger双脱氧链末端终止法,Manxam-Glibert化学降解法,焦磷酸测序技术,杂交测序法各原理及图见P100,103,105,106
自动化测序与传统方法比较
1.标化物不同:
荧光染料(自动)放射性核素(传统)
2.加样方式不同:
3.监测手段不同:
扫描仪放射自显影
PCR循环测序反应方法酶反应方法
集束话的毛细管电泳凝胶电泳
简便,快速,结果准确可靠,安全无污染,测序能力增强
30、生物芯片技术:
指通过微加工和微电子技术,在固相基质表面集成了成千上万密集排列的分子微阵列,以实现对组织、细胞、核酸、蛋白质及其他生物分子进行高效、准确、高通量检测(微阵列芯片、微流体芯片)常用:
基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、液相芯片、微缩芯片实验室等。
31、基因芯片(GeneChip):
又称DNA芯片,DNA微阵列;
将大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在载体上制成点阵,称之为芯片。
其原理:
经过标记的待测样品DNA通过与芯片上特定位置的探针按碱基配对原理杂交后,经激光聚集荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过检测杂交信号强度来获取样品分子的数量和序列信息,用计算机软件
进行数据比较和分析,从而对基因序列及功能进行大规模、高通量研究。
主要包括四个基本技术环节:
芯片微阵列制备、样品制备及标记、样品与基因芯片的杂交、信号的检测及分析。
32、蛋白质芯片:
指固定于支持节制上的多肽或蛋白质构成的阵列。
据用途分:
蛋白质功能芯片、蛋白质检测芯片。
据载体分:
蛋白质微阵列、微孔板蛋白芯片、三位凝胶块芯片。
还可分:
抗体芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、适配体芯片。
33、组织芯片:
也称组织微阵列(TMA),将成百上千个不同组织标本按预先设计的顺序排列固定在一张载玻片上所成的微阵列。
34、液相芯片:
又称悬浮阵列,流式荧光技术,是基于XMAP技术的新型生物芯片技术平台。
其核心技术是把微小的聚苯乙烯微球用荧光染色的方法进行编码,然后将每种颜色的荧光编码微球共价交联上针对特定检测物的寡核苷酸或蛋白质探针。
优点:
①仅需少量样本即可同时定性、定量检测同一样本中的多种不同目的分子——最突出优点②高通量、高效率③灵敏度高④线性范围宽⑤重复性好⑥操作简单⑦灵活性好
35、微缩芯片实验室:
又称微型生物(全:
这个字不认识)分析系统(μ—TAS)
把生物和化学等领域所(波or谱:
不认识)及的样品制备,生物化学反应和检测分析的整个过程集成化,并缩微到一张芯片上自动完成,形成所谓的微型全分析系统。
36、分子诊断法:
(目的物:
病原微生物的DNA或RNA)
对病原体特异性核酸序列的杂交,对病原体基因序列的限制性内切酶酶谱分析,限制性片段长度多态性连锁分析,对病原体基因保守序列的扩增检测基因芯片技术,支链DNA技术依赖核酸序列的扩增,连接酶链式反应等。
乙型肝炎病毒:
PCR
临床意义:
HBV感染的早期诊断,监测治疗效果,判断病情,指导制订合理的治疗方案。
其他方面结核分枝杆菌TB:
TBDNA检测可采用PCR,FQ—PCR,竞争性PCR,免疫杂交PCR等,PCR—SSCP
血红蛋白病两类:
①由于珠蛋白一级结构的变化所导致的异常血红蛋白病;
②由于珠蛋白多肽链的组成比例改变和珠蛋白含量降低所导致的地中海贫血
镰状细胞贫血:
β珠蛋白基因中第六位密码子的序列由原来的GAC改变为GTG,使对应的氨基酸由原来的谷氨酸→缬氨酸用RE酶切法诊断
地中海贫血:
分为α地贫,β地贫,γ地贫,δ地贫,δβ地贫,γβ地贫等,表型基因型见P195表11-2
第一章:
概念三个阶段
第二章:
一些基本概念及各基因组特点质粒转坐因子基因多态性SNP
第三章:
各酶概念及作用特点载体概念分类常用载体及筛选方法基本结构分子克隆的基本步骤及筛选方法
第四章:
核酸杂交基本原理探针分类标记方法常用标记物杂交类型(SouthhernBlot)
第五章:
PCR原理反应体系及优化检测与分析常见问题的分析与处理如何提高特异性
荧光定量PCR原理探针染料P90表5-4实验室分区
第六章:
DNA序列的测定4个方法的基
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