基因工程的基本操作程序1Word文件下载.docx
- 文档编号:20498035
- 上传时间:2023-01-23
- 格式:DOCX
- 页数:12
- 大小:356.25KB
基因工程的基本操作程序1Word文件下载.docx
《基因工程的基本操作程序1Word文件下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基因工程的基本操作程序1Word文件下载.docx(12页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
。
③前提条件:
有一段已知目的基因的,以便根据这一序列合成。
引物是一段特定的DNA序列,DNA合成时起指示作用,使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
④过程:
a.目的基因DNA受热变性后解旋为(加热至90~95℃);
(高温变性)
b.与单链相应互补序列结合,形成局部双链(冷却至55~60℃);
(低温退火)
c.然后在(Taq酶)的作用下从引物起始进行互补链的合成,延伸形成(加热至70~75℃)(中温延伸),如此重复循环多次。
整个过程在中完成。
⑤扩增结果:
由于延伸后得到的产物同样可以和引物结合,因而每次循环后目的基因的量可以增加一倍,即成形式扩增(约为2n,n代表扩增循环的次数)。
目的基因DNA受热形成,与结合,然后在______的作用下进行延伸形成DNA。
⑥条件:
DNA模板(上有目的基因)、引物、能量、___________________和4种脱氧核苷酸。
(3)人工合成法:
如果基因,又已知,可通过用化学方法直接人工合成。
真核细胞的基因编码区含有不能表达的内含子,因此,不能直接用于基因的扩增和表达。
获得真核细胞中的目的基因时,一般用人工合成的方法。
人工合成目的基因的方法主要有以下两种:
①反转录法操作过程
②根据已知氨基酸序列合成目的基因(逆推法)操作过程
二、基因表达载体的构建(核心)
1.表达载体的组成:
目的基因+++标记基因等。
2.启动子:
位于基因的,它是的部位,驱动基因转录产生mRNA。
3.终止子:
位于基因的,终止。
4.表达载体的功能:
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且给下一代;
使目的基因和发挥作用。
5.标记基因:
受体细胞是否含有目的基因。
6.不同受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同,基因表达载体构建上也会有所差别。
7.在构建过程中需什么工具酶?
只考虑两两结合,可以产生几种重组DNA分子?
【易混易错】
(1)目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。
如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
且链接后的序列原来的两种酶在一般情况下都不能再识别.这种双酶切的优点是①避免质粒和目的基因的自身环化②避免目的基因的反向链接.
(3)双标基因一般可以用来区别导入的是重组质粒还是普通质粒.
1.某线性DNA分子含有5000个碱基对(bp),先用限制酶a切割,再把得到的产物用限制酶b切割,得到的DNA片段大小如下表。
限制酶a和b的识别序列和切割位点如下图所示。
下列有关说法不正确的是()
a酶切割产物(bp)
b酶再次切割产物(bp)
2100、1400、1000、500
1900、200、800、600、1000、500
A.a酶与b酶切断的化学键相同
B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接
C.在该DNA分子中,a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
D.用a酶、b酶和DNA连接酶对该DNA分子反复切割、连接操作,若干循环后,
序列会明显增多
2.下面是将人的生长激素基因导入细菌d细胞内,产生“工程菌”的示意图。
所用的载体为质粒a。
若已知细菌d细胞内不含质粒a,也不含质粒a上的基因,质粒a导入细菌后,其上的基因能得到表达。
能表明目的基因已与载体结合,并在受体细胞成功表达的结果是( )
A.在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上均能生长繁殖的细菌
B.在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能生长繁殖的细菌
C.在含氨苄青霉素的培养基上能生长繁殖,但在含四环素的培养基上不能生长繁殖的细菌
D.在含氨苄青霉素的培养基上不能生长繁殖,但在含四环素的培养基上能生长繁殖的细菌
3.下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点,图l中Cmlr表示氯霉素抗性基因,Ner表示新霉素抗性基因。
请回答下列问题:
(1)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时,能否使用MspⅠ与BamHⅠ同时切割质粒与外源DNA?
。
原因是。
(2)可选用(两种)限制酶同时酶切质粒与外源DNA,酶切并连接后可获得种含目的基因的重组质粒,筛选含有该重组质粒的大肠杆菌时,需要在含的培养基上培养。
(3研究发现当CCGG序列在X酶作用下,其内部胞嘧啶残基发生变化后,MspⅠ仍能识别并切割,但HpaⅡ则不能识别,而BamHⅠ和SmaⅠ对类似变化也十分敏感,KpnⅠ则不敏感。
若在含有图1所示质粒和X酶的缓冲液中,同时加入KpnⅠ、HpaⅡ、MspⅠ和SmaⅠ并完全酶切后,则最可能得到种DNA序列。
(4)为了从基因文库中分离获取T1噬菌体抗性基因,将重组质粒导入对T1噬菌体敏感的大肠杆菌,然后将含有该大肠杆菌的菌液分别接种在预先涂有的培养基上培养,从而初步检测目的基因的表达。
三、将目的基因导入受体细胞
(一)转化:
目的基因进入受体细胞内,并在受体细胞内维持稳定和的过程。
(二)对不同生物的操作:
1.将目的基因导入植物细胞
(1)受体细胞:
(2)方法①农杆菌转化法②基因枪法:
是单子叶植物中常用的一种基因转化方法③花粉管通道法
①农杆菌特点:
易感染植物和裸子植物,对___________植物没有感染力;
Ti质粒的可转移至受体细胞,并整合到受体细胞的染色体上。
②转化过程:
目的基因插入
农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
2.将目的基因导入动物细胞
(1)受体细胞:
(2)方法:
注射技术。
(3)操作程序:
将含目的基因的表达载体→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到___性动物的____________________内发育→新性状动物。
(3)将目的基因导入微生物细胞
①常用方法:
(氯化钙法)。
②受体细胞:
,常用大肠杆菌。
(原核生物特点:
、多为、遗传物质等)
③转化过程:
a.先用处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为;
b.然后将重组表达载体DNA分子溶于中与感受态细胞混合,在下促进感受态细胞吸收,完成转化过程。
受体细胞(细菌)→CaCl2处理→细胞壁的通透性增大→重组质粒进入受体细胞→目的基因随受体细胞的繁殖而复制
▲导入的结果有三种可能1.导入的是普通质粒2.导入的是重组质粒.3什么也没导入
1.将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵,应分别采用的方法是()
A.显微注射技术 农杆菌转化法B.基因枪法 花粉管通道法
C.农杆菌转化法 显微注射技术D.基因枪法 显微注射技术
四.目的基因的检测与鉴定
1.分子水平检测
(1)导入检测:
利用技术,即将转基因生物的DNA提取出来,用或等标记的含目的基因的DNA片段作探针,使探针与杂交,如果显示出,就表明目的基因插入染色体DNA。
转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,这是目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键。
(检测目的基因的有无)
(2)转录检测:
利用,即用标记的目的基因作探针,与mRNA杂交,若显示出杂交带,则表明目的基因转录出了mRNA。
(检测目的基因是否转录出mRNA)
(3)翻译检测:
利用,即从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已形成蛋白质。
(检测目的基因是否翻译成蛋白质)
2.个体生物学水平鉴定
除了上述的分子检测外,还需要进行个体生物学水平的鉴定,即对转基因生物进行实验,以确定是否具有抗性以及抗性的程度;
有的基因工程产品需要与天然产品的功能进行,以确定转基因产品的功能活性是否与天然产品相同。
2.
回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
pIJ702是一种常用质粒(如图),其中tsr为硫链丝菌素(一种抗生素)抗性基因,mel是黑色素合成基因,其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落;
而限制酶ClaⅠ、BglⅡ、PstⅠ、SacⅠ、SphⅠ在pIJ702上分别只有一处识别序列。
(1)质粒DNA分子中的两条链靠______键维系成双链结构。
(2)以SacⅠ和SphⅠ切取的目的基因置换pIJ702上0.4kb(1kb=1000对碱基)的SacⅠ/SphⅠ片段,构成重组质粒pZHZ8.上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在表1中。
由此判断目的基因内部是否含有BglⅡ切割位点,并说明判断依据______.
(3)已知pIJ702上含mel基因的ClaⅠ/PstⅠ区域长度为2.5kb,若用ClaⅠ和PstⅠ联合酶切pZHZ8,则参照表1数据可断定酶切产物中最小片段的长度为______kb.
表1
pIJ702
pZHZ8
BglⅡ
5.7kb
6.7kb
ClaⅠ
2.2kb,4.5kb
PstⅠ
1.6kb,5.1kb
3.用某种方法特异性地拷贝“X基因”,两种引物及其与模板链的结合位置如下图所示。
经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,下列叙述错误的是
A.第一轮复制得到2个DNA分子,即①②各一个
B.第二轮复制得到4个DMA分子,即①②③④各一个
C.第三轮复制得到8个DNA分子,其中有2个等长的,也就是有2个X基因
D.第四轮复制得到16个DNA分子,其中有4个X基因
4.用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增,设计了引物Ⅰ、Ⅱ,连接部位如图所示,X为某限制酶识别序列。
扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的
A.
B.
C.
D.
5.下列关于PCR的说法正确的是
A.从理论上推测,第一轮循环产物中就能得到含引物对的DNA片断
B.至少完成两轮循环,才能获得两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C.三个循环后可得到5种长度的DNA片断
D.30次循环后,所有的DNA单链上都有引物
6..如图为某种质粒的简图,小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,P为转录的启动部位。
已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点,受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。
下列有关叙述正确的是( )
A.将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切,在DNA连接酶作用下,生成由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种
B.DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来,形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C.为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化,酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D.能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
7.MseⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ三种限制酶的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC,下图甲、乙中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
若要用上图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造,构建新的限制酶酶切位点。
在构建新的限制酶酶切位点的过程中需要使用的酶是( )
A.限制酶PstⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶B.限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶、DNA聚合酶
C.限制酶EcoRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶D.限制酶PstⅠ、限制酶EcoRⅠ、DNA连接酶
8..基因工程常用土壤农杆菌Ti质粒作为载体,需把目的基因插入Ti质粒的TDNA才能整合到植物染色体DNA上。
下图表示抗虫棉培育中使用的三种限制酶A、B、C的识别序列以及Ti质粒上限制酶切割位点的分布,抗虫基因内部不含切割位点,两侧标明序列为切割区域。
下列叙述错误的是( )
A.应该使用酶B和酶C切取抗虫基因B.应该使用酶A和酶B切割Ti质粒
C.成功建构的重组质粒含1个酶A的识别位点
D.成功建构的重组质粒用酶C处理将得到2个DNA片段
9.图1为某种常用质粒的序列图,Lac
Z基因编码的酶能使无色的X-gal变为蓝色,Ampr为氨卡青霉素抗性基因。
图2为目的基因的序列及其相关限制酶的识别序列。
(1)若要筛选成功导入目的基因的重组质粒,培养基中应加入的物质有______和______,构建重组质粒时需要的工具酶有______.
(2)采用PCR技术扩增目的基因所依据的原理是______.
(3)实验小组用BamHⅠ和BalⅡ两种限制酶切割目的基因和质粒,构建重组质粒后导入大肠杆菌中。
在筛选重组质粒的培养基上,若大肠杆菌菌落显蓝色,说明导入了______;
若大肠杆菌菌落显白色,说明导入了______.没有导入任何外源DNA的大肠杆菌______(填“能”或“不能”)在该培养基上生存。
(4)将若干个质粒和目的基因用BamHⅠ和BalⅡ两种限制酶切割后,用DNA连接酶相连,然后再用BamHⅠ和EcoRⅠ切割成功连接后的产物,获得了长度为0.7kb、2.8kb、1kb和2.5kb四种长度的DNA片段,则目的基因的长度为______kb.(已知目的基因的长度大于1kb,1kb=1000个碱基对)
10.下图表示利用细菌中抗虫基因培育抗虫玉米的过程,其中①~⑧表示操作步骤,a、b表示分子,c~e表示培养过程,其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养。
下列有关叙述正确的是
A.图中需要用到限制酶的是步骤①②B.图中导入目的基因的是步骤④
C.步骤⑤的主要目的是扩增目的基因D.脱分化和再分化的步骤分别是⑦和③
▲扩增目的基因的方法:
①PCR技术②将目的基因导入大肠杆菌。
11.重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。
该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景。
如图是利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。
其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中引物2、引物3),分别PCR,获得有重叠链的两种DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得目的基因。
结合所学知识,分析下列问题。
(1)引物中G+C的含量影响着引物与模板DNA结合的稳定性,引物中G+C的含量越高,结合稳定性________。
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中,必须将引物l、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为___________________。
(3)若在引物l和引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均复制一次,共产生____种双链DNA分子。
(4)在引物1、引物2组成的反应系统中,经第一阶段形成图示双链DNA至少要经过____次复制。
(5)若利用微生物扩增该目的基因,其基本步骤包括:
______、______、微生物的筛选和培养、从菌群中获取目的基因。
【参考答案】
学习过程
目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
基因表达载体的构建。
一、1.基因2.①DNA片段;
储存②所有;
一部分
cDNA文库较小、无启动子、无内含子、只含某种生物的部分基因、可以进行物种间的基因交流;
基因组文库较大、有启动子、有内含子、某种生物的全部基因、部分基因可以进行物种间的基因交流。
③核苷酸序列、染色体、mRNA、蛋白质
(2)PCR①复制②DNA双链复制③核苷酸序列
④两条DNA单链;
相应的引物DNA聚合酶(Taq酶——一种热稳定的DNA聚合酶)
⑤DNA聚合酶(Taq酶——一种热稳定的DNA聚合酶)
PCR技术与DNA复制的异同点?
例1、D
二、1.启动子;
终止子。
2.首端;
RNA聚合酶识别和结合3.尾端;
转录
4.遗传;
表达5.鉴别7.限制酶DNA连接酶3种
例2、C
三、
(一)表达
(二)1.①双子叶;
大多数单子叶;
T-DNA(可转移的DNA)②Ti质粒的T-DNA上;
2.
(1)显微
(2)提纯;
雌;
输卵管或子宫
3.
(2)Ca2+;
感受态细胞;
感受态。
例3、C
四、DNA分子杂交分子杂交抗原—抗体杂交抗虫或抗病的接种
例4、
(1)aa
(2)基因枪法(花粉管通道法)(3)耐盐基因(目的基因);
一定浓度盐水浇灌(移栽到盐碱地中)
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因工程 基本 操作 程序