1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质精Word文档格式.docx
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2001-11-221
基金项目:
国家自然科学基金资助项目(39870581;
英国达尔文项目
(162/8/0651
作者简介:
陈吉祥(1963-男,副研究员,博士后,从事海洋微生物学与免疫学1
子,已从霍乱弧菌、创伤弧菌-3][4]从11种胞外蛋白酶,证明其对虹鳟;
Lamas[5]利用鳗弧菌及其胞外蛋白产物对虹鳟进行腹腔注射后,虹鳟表现出极为相似的症状。
肖慧等[6]从山东沿海养鱼场发病鱼的体内分离到1株致病性鳗弧
菌,感染实验表明该菌株对花鲈(Lateolabrax
japanicus等海水养殖鱼类有较强的致病性,常伴有
严重的血管出血及组织损伤、出血等病症。
本研究从其胞外产物中分离纯化了1种胞外蛋白酶,并进行酶的理化性质研究,以探讨该菌胞外产物对鱼类组织损伤及致病作用的机制。
1 材料和方法111 实验菌株
致病性菌株W-1分离自山东省莱州湾海区发
病的花鲈(Lateolabraxjapanicus,经细菌形态学、
Biolog系统鉴定为鳗弧菌(Vibrioan2
guillarum。
112 试剂及仪器
DEAE2SepharoseFastFlow、Sephadex2G100购
自Pharmacia公司,SDS、丙烯酰胺、牛血清蛋白、N,N’2亚甲基双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、PMSF
等购自上海生物工程公司,其余试剂为国产分析纯。
蛋白层析系统购自上海沪西仪器厂,UV-730紫外分光光度计购自日本岛津公司,DYY-Ⅲ垂直板电泳仪购自北京六一仪器厂。
113 实验方法
11311 细菌培养及胞外产物获得 细菌的培养用2216E海水液体培养基,培养温度28℃,培养时间24h,振荡频率为180r/min。
培养物于4℃5000r/min离心10min,收集上清液,再分别用0145μm
和0120μm滤膜过滤,滤液-20℃保存备用。
11312 酶的分离纯化
(1硫酸铵盐析 将上述培养过滤液取出置室
温融化后,缓慢加入(NH42SO4粉末至80%饱和度,4℃过夜,于10000r/min离心15min,收集沉淀,并溶解于40mL0.02mol/LpH718的Tris2HCl缓冲液,于4℃条件下透析24h,其间充分换水并搅动。
最终体积50mL左右。
(2DEAESepharoseFastFlow层析
将透析
液直接加入经0102mol/LpH7.8Tris2HCl缓冲液平衡好的DEAE-SepharoseFastFlow柱(110cm×
15cm,用含0~0.5mol/LNaCl的相同缓冲液梯度洗脱,流速24mL/h,每管1mL收集洗脱液,测定蛋白吸收和酶活力。
(3SephadexG2100柱层析 将收集的上述酶溶液充分透析,并用PEG浓缩至体积为6mL左右,然后加入到用0102mol/LpH7.8Tris2HCl平衡的SephadexG2100柱(1cm×
100cm。
用相同缓冲液洗脱,流速15mL/h,每管1mL收集洗脱液,测定蛋白吸收和酶活力。
收集酶活力集中部分,冷冻干燥。
11313 酶活力测定 参照Inamura方法[4],以偶氮酪蛋白为底物。
具体方法为015mL偶氮酪蛋白溶液(5mg/mL,pH8.0Tris2HCl缓冲液配制,加入011mL酶溶液,再加入014mL双蒸水,混匀后于25℃保温20min。
加入5%的三氯乙酸溶液315mL,于室温3000r/min离心5min,收集上清加入015mol/LNaOH溶液4.5mL,于440nm
OD值。
在该条件下OD值每增加1
1个酶活力单位(U。
11314 Brad2ford方法进行[7],。
11315 SDS2PAGE 蛋白酶的分子量测定采用SDS2PAGE垂直板电泳法:
浓缩胶浓度3%,分离胶浓度10%,考马斯亮蓝R2250染色,中分子量标准蛋白包括磷酸化酶B、牛血清蛋白、卵清蛋白、羧肽酶、蛋清溶菌酶。
11316 温度对酶活性的影响 按11313方法在不同温度下测定酶活力,确定酶的最适温度,另外将蛋白酶溶液于不同温度保温,每隔15min取样并迅速冷却到室温,再测定酶的活力,确定温度对酶活力影响。
11317 pH对酶活力的影响 分别以不同pH的缓冲液配制底物并稀释酶液,再按11313方法测定酶活力,确定酶的最适pH。
11318 酶抑制剂及金属离子对酶活力影响 将各种酶抑制剂及金属离子分别加入到酶溶液中,于25℃保持10min,再用常规方法测定酶活力,并计算酶的活力剩余。
2 结果
211 鳗弧菌蛋白酶的分离纯化
鳗弧菌蛋白酶粗酶液经硫酸铵盐析后,在DEAE2Sepharose柱层析中,2峰,在SephadexG1002峰,1,
性为15U/,4142,酶的收率为
根据该酶在SDS-PAGE电泳中的迁移率,通过作图法求得酶的分子量3617kD(图1。
213 温度对酶活力的影响
该酶的最适反应温度为50℃(图2,是一热不稳定酶,温度较高时,随时间延长,活力部分丧失,超过70℃时15min酶活力即完全丧失(图3。
214 pH对酶活力的影响
该酶的最适pH为710,pH<
4时蛋白酶活力很低,而在pH6~10时蛋白酶较稳定(图4。
表1 鳗弧菌胞外蛋白酶的纯化
Table1 PurificationofproteaseofVibrioanguillarumW-1
纯化步骤Purificationprocess体积/mL
Volume
总活力/U
Totalactivity
比活力/(U・mg-1
Specificactivity
得率/%
Yieldrate
纯化倍数Relativepurification
培养过滤液
Culturefilter
9001001193×
1067114×
1041001001100硫酸铵沉淀
Ammoniumsulfate
501001126×
1069166×
104621641135
DEAE2sepharosefastflow柱层析
DEAE2sepharosefastflow
61007192×
1052120×
105411073108
SephadexG2100层析SephadexG2100281004197×
1052196×
105251234142913
第4期 陈吉祥等:
图1 SDS2PAGE电泳测定鳗弧菌胞外蛋白酶的分子量
Fig.1 Molecularweightanalysisofproteasefrom
V.anguillarumbySDS2PAGE.
A1标准分子量蛋白:
磷酸化酶b(97400,牛血清白蛋白(66200,
卵清蛋白(42700,碳酸酐酶(31000,溶菌酶(14400;
B1鳗弧菌蛋白酶
A.Standardmolecularweightproteins:
Phosphorylaseb(97
400,Bovineserumablumin(66200,Ovalbuminb(42700,Carbonican2hydrase(31000,Lysozyme(14400;
B.Proteasefrom.
angillarum.
图2 鳗弧菌胞外蛋白酶的最适反应温度
Fig.2 OptimumtemperatureofproteasefromV.anguil2
larum
215 酶抑制剂和金属离子对酶活力的影响
如表2所示,SDS可部分抑制酶的活力,2
mol/L的Urea对酶活力影响不大,而增加到8mol/L时酶活力部分丧失;
1mmol/L的PMSF对酶活力无影响,1mmol/L的EDTA完全抑制酶的活性
。
部分金属离子对该酶有一定的抑制作用,其中Cu2
+、Fe2+、Fe3+、Zn2+抑制作用较为明显,而Ca2+对酶有一定程度的激活作用(表3。
图3 温度对鳗弧菌胞外蛋白酶稳定性的影响
Fig.3 Effectsoftemperatureonstabilityofproteasefrom
V.anguillarum
图4 鳗弧菌胞外蛋白酶的最适pH
Fig.4 OptimumpHofproteasefromV.anguillarumW-1
表2 抑制剂对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响
Table2 EffectsofinhibitorsonV.anguillarumW21pro2
tease
抑制剂
Inhibitor
浓度/
(mmol・L-1
Concentration
酶活力/
(U・mL-1
Enzymeactivity
相对活力/%Relativeactivity影响
Effect
对照
Control9200
100100EDTA0110595064167-1100
00100-SDS011735079189-1100265028180-
Urea200092001001008000695075154-PMSF
01109500100100100
9500
10000
3 讨论
胞外蛋白酶被认为是许多细菌病原的毒力因子,但不同的细菌所产生的胞外蛋白酶不同,即使同一菌种的不同菌株其胞外蛋白酶也有一定的差异,
23 中国水产科学 第9卷
Miyoshi等[8]从创伤弧菌(Vibriovulnificus分离得到一种金属蛋白酶,其分子量为45kD;
Arnesen等[9]发现杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicidia的个别菌株胞外产物含有高分子量(89~100kD和低分子量(37kD的2类蛋白酶,而大部分菌株只有高分子量蛋白酶,提纯后的低分子量蛋白酶是一种金属蛋白酶,能被EDTA和过量的Zn2+所抑制。
Inamura等[4]从一株致病性鳗弧菌胞外产物中分离到的蛋白酶分子量为36kD,该酶的最适pH为7~8,最适温度50℃,能被EDTA所抑制。
Farrell等[10]通过硫酸铵盐析、DEAE2Sepharose层析、SepharcrylS2200层析及DEAE高效液相层析从鳗弧菌514分离纯化到分子量为38kD和40kD的2种蛋白酶,前者在pH中性偏碱的条件下保持最大活力,对丝氨酸、酪氨酸或酸性蛋白酶抑制剂不敏感,而被EDTA所抑制,属于金属蛋白酶。
表3 金属离子对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响
Table3 EffectsofmetalionsonV.anguillarumW212tease
抑制剂Inhibitor
(-
Control
9200100100
CaCl201109550103126+110010600115100+ZnSO40110275029185-11001501163-MgSO40110790085187-1100755082106-FeSO40110725078180-1100360039130-FeCl30110500154-1100160017139-CuSO40110400143-110000-
本实验从鳗弧菌W-1培养液分离到的胞外蛋白酶分子量为3617kD,是一热不稳定性蛋白酶,丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶无抑制作用,110mmol/L的EDTA能使酶活力完全丧失,说明该酶不属于丝氨酸蛋白酶类,而是一种金属蛋白酶;
金属离子Cu2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mg2+等都对该酶具有抑制作用,而Ca2+对酶有一定的激活作用,可能与活性部位金属离子的取代或位阻作用有关;
在酸性环境酶活力迅速丧失,在pH6~10保持较高的酶活性,在碱性条件下酶活力较稳定,该金属蛋白酶与Farrell[10]分离的低分子量组分相似。
各种胞外蛋白酶通过不同方式对宿主发生作用,如霍乱弧菌金属蛋白酶可破坏宿主细胞受体,切断和激活霍乱毒素A亚单位,并能降解肠粘膜以利于霍乱毒素的作用;
创伤弧菌金属蛋白酶能通过降解基质膜Ⅳ型胶原蛋白引起溶血反应;
嗜水气单胞菌胞外蛋白酶能引起鲫鱼的败血症症状[11],有关鳗弧菌W-1胞外蛋白酶的作用,我们将另文报道。
参考文献:
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80-841
123第4期 陈吉祥等:
1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质
Purificationofanextracellularproteasefrom
Vibrioanguillarumanditsphysicochemicalproperties
CHENJi2xiang,LIUShuang,LIYun,WANGXiang2hong,
DUZong2jun,YUDe2hua,JIWei2shang,
(DarwinLaboratory,CollegeofMarineLifeSciences,OceanUniversityofQingdao,Qingdao266003,China
Abstract:
AstrainofVibrioanguillarumW-1wasisolatedfromthediseasedseaperch(Lateolabraxjaponi2cusinLaizhouBay,ShandongProvince,andanextracellularproteasewaspartiallypurifiedfromthecultureso2lutionoftheV.anguillarumbyammoniumsulfate,DEAE2epharosefastflowandSephadexG-100.There2sultsshowthat,themolecularweightofthepurifiedenzymefromV.anguillarumbySDS-PAGEis36.7kD;
theoptimumtemperaturefortheenzymeactivityis50℃,andtheenzymeisheatlabilethatitwouldentire2lyloseitsactivityin15minat70℃;
theoptimumpHis7.0;
1mmol/LofEDTAandsomemetalions(Cu2+,Fe2+,Fe3+,Zn2+caninhibittheenzymeactivity,butCa2+isonthecontrarythatitcantheenzymetosomeextent.1mmol/LofPMSFhasnoeffectontheenzyme,andtheenzymeisakindofmelallo2protease.
Keywords:
Vibrioanguillarum;
extracellularprotease;
;
赵法箴 男,1935年5月出生,研究员,中国工程院院士。
海洋生物学家。
现任中国水产科学研究院黄海水产研究所名誉所长,农业部科学技术委员会委员,中国水产学会副理事长,全国政协委员。
长期从事海水养殖、对虾养殖与及实验生态研究。
主持完成“对虾工厂化全人工育苗技术”研究,获国家科学技术进步一等奖、世界知识产权组织金奖,
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- 致病性 弧菌 蛋白酶 分离 纯化 性质