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图2-1制作琼脂平板法
3.肉汤琼脂半固体培养基制备
①加入琼脂0.35克至100毫升pH7.8的肉汤中,加热融化后,用脱脂棉过滤,补足失水。
②分装于小试管(10×
100毫米),每管3毫升。
高压蒸汽下121℃灭菌15~20分钟后直立冷凝即成。
(二)纯种细菌接种法
1.斜面培养基接种法(示教)
(1)菌种:
大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物。
(2)培养基:
琼脂斜面培养基。
【方法】
(1)左手拇指、食指、中指及无名指分别握持菌种与待接种的培养基管(图2-2),使菌种管位左,培养基管位右,斜面部均应向上,勿成水平,以免管底凝结水浸润在培养基表面甚至沾湿棉塞。
图2-2斜面培养基接种法
(2)右手拇指和食指分别转动两管棉塞,以便接种时易于拔取。
(3)右手执持接种环(姿势与握铅笔似),在火焰中烧红灭菌,欲伸入试管内的接种杆部分亦要迅速通过火焰2~3次以烧去其表面的杂菌。
灭菌过的接种环要握持手中,勿再碰及它物。
(4)以右手手掌与小指,小指与无名指分别拔取并挟持两管棉塞,将两管管口迅速通过火焰数次灭菌。
(5)以灭菌并已冷却的接种环伸入菌种管,从斜面上挑取菌苔少许。
退出菌种管,再伸进待接种的培养基管,自斜面底轻轻向顶蜿蜒划线或在斜面作上下涂布,慎勿划破培养基表面(图2-3)。
沾菌的接种环,进出试管时,均不应触及试管内壁。
(6)接种毕,重新烧红接种环灭菌后放下。
两管管口迅速通过火焰2~3次,塞回棉塞并以右手拇、食两指分别将两管棉塞转进至原来位置。
37℃孵育18~24小时后观察生长情况。
图2-3斜面培养基蜿蜒划线法(左)及上下涂带法(右)
2.液体培养基接种法(示教)
(1)菌种:
(2)培养基:
肉汤培养基。
(1)如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的肉汤管。
(2)接种环灭菌冷却后,伸入菌种管挑取少量菌苔退出菌种管,再伸入肉汤管。
在接近液面的管壁上轻轻磨研,再沾少许肉汤调和,使菌混合于肉汤中(图2-4)。
(3)接种完毕,接种环重行灭菌后放下。
塞好棉塞,37℃孵育18~24小时后观察生长情况。
图2-5半固琼脂培养基接种法
图2-4液体培养基接种法
3.穿刺接种法(半固体接种法)示教
半固体琼脂培养基。
(1)如斜面培养基接种法握持菌种管及待接种的半固体琼脂培养基。
(2)右手握接种针,灭菌冷却后,以针挑取菌苔。
垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出(图2-5)。
二、细菌的生长现象(示教)
1.菌种:
大肠杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
枯草杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
甲型链球菌血琼脂斜面18~24小时培养物
变形杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
痢疾杆菌琼脂斜面18~24小时培养物
2.培养基
普通肉汤培养基、血清肉汤培养基
琼脂平板、琼脂斜面、半固体培养基
1.将大肠杆菌、枯草杆菌分别接种于2支普通肉汤培养基;
甲型链球菌接种于血清肉汤培养基,37℃孵育18~24小时后取出,观察结果。
2.将变形杆菌、痢疾杆菌分别接种于2支半固体培养37℃孵育18~24小时后取出,观察结果。
3.将大肠杆菌接种于琼脂平板及琼脂斜面培养基,37℃孵育18~24小时后取出,观察结果。
三、分离培养法——板划线法(操作)
葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液。
琼脂平板。
1.烧灼接种环,待冷(约等待1分钟左右),取一接种环混合菌液。
2.左手抓握琼脂平板培养基(皿盖留在桌上),使尽量直立,以免空气中杂菌落入,并靠近火焰周围。
右手握持沾菌的接种环在琼脂平板上端来回划线,涂成一薄膜(约占平板总面积的1/10)。
划线时使接种环面与平板表面成30~40度角轻轻接触,以腕力在平板表面作轻快的滑移动作,接种环不应嵌进培养基内。
3.烧灼接种环,以杀灭环上留剩的菌液。
待冷(环是否冷却?
可先在平板培养基的边缘空白处接触一下,若琼脂溶化表示尚未冷却,宜再稍等复试之)将环通过薄膜处作连续划线(约占平板的1/5~1/6),划毕再用火焰灭菌。
冷后作同样的划线,共计4~5次(图2-6、7)。
4.划线完毕,将琼脂平板培养基覆盖皿盖,并在培养皿底玻璃面,用记号笔
注明接种菌名,接种者姓名及班级、日期等(以后凡接种的培养皿、试管等,均要照此要求,用记号笔注明)。
将培养皿倒置放进孵育箱培养,这样可避免培养过程中凝结水自皿盖滴下,冲散菌落。
5.37℃孵育24小时后取出,观察琼脂平板表面生长的各种菌落,注意其大小、形状、边缘、表面结构、透明度、颜色等性状。
图2-7孵育后菌落的分布情况法
图2-6平板划线法
四、细菌代谢产物的检查
(一)单糖发酵试验(示教)
【原理】
不同细菌具有不同的糖分解酶,故分解各种糖后的产物也不相同,有的产酸,有的尚有气体形成,借此可鉴别各种细菌。
单糖发酵试验在肠道病原菌的鉴定中尤其重要。
单糖发酵管是将葡萄糖、乳糖或麦芽糖等加入蛋白胨水培养基内,使其最终浓度为0.75~1%,并加入一定量的指示剂及一只小倒管。
接种细菌并孵育一定时间后,若该菌具有分解某种糖的酶,分解产酸就会使指示剂变色。
如指示剂为酸性复红则变为红色;
溴甲酚紫则呈黄色。
若有气体形成,则小倒管内有气泡集聚。
1.菌种;
大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌琼脂斜面。
2.培养基:
乳糖发酵管。
将大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种于3支乳糖发酵管,37℃孵育18~24小时,取出观察并记录结果。
(二)(Voges—Proskauer)试验(操作)
【原理】
VP试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。
两菌在糖代谢中,分解葡萄糖后都能产生丙酮酸;
丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。
产气杆菌并可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇,在碱性环境下被空气中氧气氧化为二乙酰,后者与蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用,生成红色化合物,此为VP试验阳性。
在试验中加入α-萘酚,可加速这个反应。
大肠杆菌不能将丙酮酸脱羧故VP阴性。
2CH3COCOOH(丙酮酸)CH3COCHOHCH3(乙酰甲基甲醇)
-2H
+KOH
CH3COCHOHCH3CH3COCOCH3(二乙酰)
NH2N-C-CH3
CH3COCOCH3+HN-C(胍)NH-C(红色化合物)+2H2O
大肠杆菌、产气杆菌斜面18~24小时培养物。
葡萄糖蛋白胨水培养基。
3.40%KOH溶液(含0.3%肌酸)、6%α-萘酚酒精溶液,毛细吸管。
1.分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支葡萄糖蛋白胨水培养基中。
2.37℃孵育48小时后取出分别加入1毫升KOH和α-萘酚溶液,摇匀。
静置桌上5~15分钟内出现红色者,为阳性反应。
(三)甲基红(M.R)试验(操作)
本试验可鉴别大肠杆菌和产气杆菌。
产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇,故培养物中形成酸类较少,pH值在5.4以上。
因此加入指示剂甲基红(MethylRed)后,呈现桔黄色,此为甲基红试验阴性。
而大肠杆菌分解丙酮酸,产生酸类较多,pH在4.5或更低,故甲基红呈现红色(阳性)。
1.菌种:
葡萄糖蛋白胨水培养基
3.甲基红
2.37℃孵育2—3天取出,分别滴加甲基红试剂2~3滴后立即观察。
阳性者呈红色,阴性者呈黄色。
(四)枸橼酸盐利用试验(操作)
枸橼酸盐培养基中仅含无机盐及唯一有机物枸橼酸盐.一般细菌能利用磷酸二氢铵作氮源,但不一定能分解枸橼酸盐取得碳源,因此根据能否利用枸橼酸盐可鉴别不同细菌。
产气杆菌可以利用枸橼酸盐作为碳源,就能在本培养基上生长,形成菌落。
且分解后,有碱性的碳酸盐生成,使培养基的pH值(原在7.0以下)升高,转为碱性,则溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。
大肠杆菌不能分解枸橼酸盐,得不到碳源,不能生长,指示剂也就不会变色,培养基仍为原来绿色。
枸橼酸盐培养基.
1.分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支枸橼酸盐培养基上。
2.37℃孵育24小时后观察。
有菌苔出现,培养基颜色变为深蓝色者,是为枸橼酸盐利用试验阳性。
(五)吲哚(Indol)试验(操作)
有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。
吲哚无色不能直接察见,加入对二甲基氨基苯甲醛试剂(吲哚试剂),作用后能形成红色的玫瑰吲哚,则被肉眼所识别。
1.菌种:
蛋白胨水培养基。
3.试剂:
吲哚试剂、乙醚。
1.分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支蛋白胨水培养基中。
2.37℃孵育48小时后取出,每管加2~3滴吲哚试剂于液面上,在接触面呈玫瑰红色(环状)者为阳性;
仍呈黄色者为阴性。
若颜色不明显,可加4~5滴乙醚至培养物中,摇匀,使乙醚分散至培养物中。
将培养物静置桌上,待乙醚小滴上升至培养物液面后,再加吲哚试剂,这样,若培养液内有吲哚存在,就可被取而集中在乙醚层中,遇到试剂后颜色反应较明显。
(六)尿素分解试验(示教)
有的细菌具有尿素酶,能分解尿素形成大量的氨,使培养基pH值上升而变成碱性,使酚红指示剂呈现红色,是为阳性反应。
变形杆菌、痢疾杆菌斜面18~24小时培养物。
尿素培养基。
1.分别接种变形杆菌、痢疾杆菌于尿素培养基中。
2.37℃孵育18~24小时后观察结果。
(七)硫化氢试验(示教)
某些细菌能分解培养基中胱氨酸等含硫氨基酸,生成硫化氢。
硫化氢遇铁(如硫酸亚铁)或铅离子,则形成黑褐色的硫化亚铁(或硫化铅)沉淀物,黑色沉淀物愈多,表示生成的硫化氢量愈多,硫化氢试验用的培养基中含有硫代硫酸钠,它是一种还原剂,能保持还原环境,使形成的硫化氢不再被氧化。
大肠杆菌,变形杆菌的琼脂斜面18~24小时培养物。
醋酸铅培养基。
1.分别穿刺接种大肠杆菌、变形杆菌于醋酸铅培养基中。
2.37℃孵育24小时后观察结果。
五、常用灭菌器及滤菌器(录像)
(一)高压蒸气灭菌器
1.构造:
高压蒸气灭菌器(图2-8)是一个双层的金属圆筒,两层之间盛水。
外层坚厚,其上或前方有金属厚盖。
盖旁附有螺旋,借以紧闭盖门,使蒸气不能外溢。
因而随着蒸气压力升高,其温度亦相应增高。
它们之间的关系如下表:
不同蒸气压力能达到的温度
蒸气压力
(温度℃)
磅/平方吋
公斤/平方厘米
5
8
10
15
20
25
30
O.35
0.56
O.70
1.05
1.40
1.75
2.10
108.8
113.O
115.6
121.3
126.2
130.4
134.6
高压蒸汽灭菌器上装有排气阀门、安全活塞,以调节器内蒸汽。
有温度计及压力表,以示内部的温度和压力。
器内装有带孔的金属搁板,用以放置欲灭菌物件。
2.加水至器内,放入被灭菌物件。
将器盖上,螺旋转紧使之密闭。
器下用煤气或电等加热,同时开排气阀门,使器内冷气完全逸出,否则压力表上所示压力并非全部是蒸气压力,器内不能达到理想温度,灭菌将不完全,器内温度和冷气排除量的关系见下表。
高压蒸汽灭菌内温度与空气排除量的关系
压力表上所示
能达到的温度(℃)
压力
(磅/平方吋)
空气完
全排除
空气2/3
排除
空气1/2
空气1/3
空气全
未排除
109
115
121
126
130
135
100
94
105
112
118
124
128
90
72
12l
待空气全部排出,关闭排气阀.继续加热,待压力表渐升至所需磅数(一般是15磅),减少炉火,维持15-20分钟。
若采用蒸汽加热,则可直接将蒸汽通入灭菌器内,至所需温度即可(图12)。
灭菌时间到达后,停止加热或关闭蒸汽,待压力逐渐自行降至零时,徐徐打开排气阀,排除余气、开盖取物。
切不可在压力尚未降低时突然打开排气阀门,放气减压。
因为这样,将使瓶内液体等冲出外溢。
高压蒸汽灭菌为最可靠方法,凡耐高热潮湿的物件,如培养基、生理盐水、衣服、纱布、棉花等敷料、玻璃器材、传染性脏物及细菌培养物等都可应用本法消毒灭菌。
1、压力表
2、金属外壳
3、灭菌室
4、安全活塞
5、排气门
6、蒸汽通入管
7、蒸汽放出管
图2-8高压蒸气灭菌器
(二)阿诺(Arnold)流动蒸汽灭菌器
阿诺流动蒸汽灭菌器(图2-9)的构造象一般的蒸笼,上端插入温度计。
先加水于双层的金属锅内,锅底下加热。
因双层间水的容量不大,容易煮沸而形成蒸汽,使器内温度上升至100℃。
蒸汽通经中央圆筒直至灭菌器内的被消毒物件。
多余的蒸汽自器的隙缝逸出。
遇及温度低于100℃的外壳时,重新凝结成水,返回于水锅内,这样可以不需经常加水。
另一形式的流动蒸汽灭菌器(图2-10)是以金属板或石棉板制成圆筒形或长方形箱,底层盛水,其上有1~2层带孔金属隔板,借以放置消毒物件。
箱顶或旁侧有进水漏斗和排水龙头。
图2-9阿诺氏流动蒸气灭菌器、蒸笼式剖面
图2-10阿诺氏流动蒸气灭菌器
2.用法:
向锅内加水至略低于搁板下面,再将欲灭菌物件放入器内搁板上。
点火加热以产生蒸汽,使锅内温度达100℃并维持30分钟左右,在普通大气压下,蒸汽温度不会超过100℃,细菌繁殖体一般可被杀死,但不能杀灭芽胞。
所以,使用流动蒸汽灭菌,往往须按灭菌的性质进行间歇灭菌,每日一次,连续三次。
本法用于不耐高温的糖类、马铃薯、牛奶等培养基的灭菌。
(三)干热灭菌器(烤箱)
3.构造:
干热灭菌器(图2-11)是由双层铁板制成的长方形金属箱,外壁内层装有隔热的石棉板,底下放置大型火炉,或在箱壁中装置电热线圈或煤气管道,上有数孔,安插温度计及供空气节流通用。
箱前有铁门及玻璃门,箱内有金属板架数层。
电热烤箱的前下方装有温度调节器,可以保持所需的温度。
4.用法:
将培养皿、吸管、试管等玻璃器材包装后放入箱内,闭门加热。
当温度上升至160~170℃,保持2小时.到达时间后,停止加热,等温度自然下降至40℃以下,方可开门取物。
否则冷气突然进入,易引起玻璃炸裂,且热空气外溢,往往会灼伤取物者的皮肤。
一般吸管、试管、培养皿、凡士林、液体石蜡等用本法灭菌。
(四)滤菌器:
滤菌器由孔径极小(一般孔径在0.10-1微米之间,常用0.22微米孔径的过滤膜即可达到除菌的目的),能阻挡细菌通过的石棉、醋酸纤维膜或玻璃细砂等制成。
种类多,常用的有:
1.塑料滤器:
由塑料制成,中间滤膜为醋酸纤微膜,多为一次使用。
2.不锈钢滤器:
由不锈钢制成,中间可根据需要安装石棉滤板或醋酸纤维滤膜等,同时,在过滤时还可以加压,以加快过滤速度。
(图2-12)
过滤法用以除去糖溶液、血清、腹水、某些药物等不耐热液体中的细菌,也可用来分离病毒、细菌和其毒素等。
图2-12塑料滤器、不锈钢滤器
图2-11干热灭菌箱
六、常用物理消毒法
(一)细菌对湿热的抵抗力(操作)
【材料】
大肠杆菌,枯草杆菌18~24小时培养物。
2.培养基:
肉汤管。
3.65℃水浴箱、100℃水浴箱。
1.取8支肉汤管,其中4支接种枯草杆菌,4支接种大肠杆菌各一接种环。
2.取接种有枯草杆菌和大肠杆菌的肉汤管各1支,置65℃水浴箱内加热5分钟,取
出,立即以自来水冲凉。
3.同2,但改为65℃加热30分钟。
4.同2,但改为100℃加热5分钟。
5.各留下一支作为对照。
6.将所有8支种有细菌经不同处理的肉汤管置37℃孵育,18~24小时后观察
各管生长情况。
(二)紫外线对细菌的作用(操作)
医学上通常使用紫外线灯以产生人工紫外线。
波长为200~300nm的紫外线具有杀菌作用,其中以265~266nm最强,这与DNA的吸收光谱范围一致。
其杀菌机理是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成,从而干扰了DNA的复制,导致细菌死亡。
大肠杆菌肉汤18~24小时培养物,枯草杆菌肉汤24~48小时培养物。
3.紫外线灯消毒柜。
1.用记号笔将琼脂分成二部分,用接种环沾取大肠杆菌或枯草杆菌菌液多
环,分别在琼脂平板培养基一部分的表面上来回涂满。
2.将分别涂满二菌的琼脂平板用皿盖盖住一半后(二菌应都被遮去1/2),
在离紫外线灯的2~3尺处,直接受紫外线照射30分钟。
然后盖好皿盖,37℃孵育24小时后观察生长情况。
七、生物因素对细菌的影响
(一)细菌对抗生素的敏感性测定(药敏试验)(示教)
金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌18~24小时肉汤培养液、琼脂平板培养基、抗生素纸片(浸沾一定浓度的青、链、氯、庆大霉素后,37℃烘干备用)、尖头镊子。
1.取琼脂平板培养基2块,分别于其底部玻璃上注明金黄色葡萄球菌及痢疾
杆菌,并用蜡笔将平皿底部划分四等分,分别注明青、链、氯、庆大霉素。
2.将二菌菌液分别涂于上述二个培养基平板上。
3.镊子经火焰灭菌,镊取各药物纸片,分别贴于涂有细菌的培养基平板表面
相应位置上。
4.置37℃中孵育18~24小时,观察纸片周围有无抑菌圈,并比较各抑菌圈
的大小,判断二菌对抗生素的敏感度。
附:
纸片法药敏试验纸片含药量和结果解释(NCCLS1998年)
细菌种类
抗生素
纸片
含药量
抑菌环直径
耐药中介敏感
葡萄球菌属
青霉素
10U
≤28-≥29
红霉素
15μg
≤1314~22≥23
庆大霉素
10μg
≤1013~14≥15
万古霉素
30μg
--≥15
环丙沙星
5μg
≤1516~20≥21
克林霉素
2μg
≤1415~20≥21
肠杆菌科
氨苄西林
lOμg
≤1314~16≥17
头孢西丁(
≤1415~17≥18
丁胺卡那
≤1415~16≥17
头孢他啶
≤1415~17≥18
复方阿莫西林
20/10μg
≤1314~17≥18
NCCLS:
美国临床实验室标准化委员会
(二)噬菌体对细菌的作用—特异性裂解试验(平板法)(示教)
大肠杆菌及痢疾杆菌琼脂斜面培养物、琼脂平板培养基、痢疾杆菌噬菌体。
1.取琼脂平板一只并划分三等,分别标明1、2、3。
2.以接种环将痢疾杆菌分别密涂于1、3两处,2处涂布大肠杆菌。
3.用接种环沾取痢疾杆菌噬菌体加于1、2处的中央,另取l接种环肉汤放
于3处中央。
4.将此培养基平板置37℃孵育12~24小时,观察噬菌斑出现的位置加以分
析。
附录:
一、单糖发酵管培养基制备:
配制各种单糖成20%浓度的水溶液,8磅蒸汽压力下灭菌15分钟。
取pH7.6的蛋白胨水1000毫升,加入1.6%溴甲酚紫液1毫升,混合后分装于内置一支玻璃小倒管的10×
100毫米试管,每管约3-4毫升,15磅蒸汽压力下灭菌15分钟。
取出后各管贴上颜色标签或在棉塞上染以颜色。
在细菌学中,通常红色代表葡萄糖、黄色代表乳糖、白色甘露醇、紫色麦牙糖等,最后以无菌操作加入相应的灭菌糖溶液至每管中,使最终浓度为l%。
二、IMViC试验所需培养基,试剂
(一)培养基
1.蛋白胨水:
将蛋白胨10克、氯化钠5克溶解于蒸馏水1000毫升中,调
整酸碱度至pH7.6,15磅蒸汽压下灭菌20分种,若作吲哚试验者,宜采用多胨,因其中含色氨酸较多。
2.葡萄糖蛋白胨水:
溶解蛋白胨5克,葡萄糖5克、磷酸氢二钾5克于蒸
馏水1000毫升中,调整至pH7.2,滤纸过滤,分装后,经8磅蒸汽灭菌15分钟。
3.枸橼酸盐斜面培养基:
溶解磷酸二氢铵0.1克、硫酸镁0.02克、磷酸氢
二钾0.1克、枸橼酸钠0.2克、氯化钠0.5克于蒸馏水100毫升中,加入琼脂2克。
加热溶化之。
酸碱度调整至pH6.8,加入指示剂0.5%溴麝香草酚兰酒精溶液2毫升。
摇匀,脱脂棉过滤,分装,15磅蒸汽压下灭菌20分钟,趁热制成斜面。
制就的枸橼酸盐培养基应呈绿色。
(二)
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- 微生物学 试验 目的 要求