溶液各类配制Word格式.docx
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磷酸盐缓冲溶液(Phosphate-bufferedsaline,PBS)
磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压,因此,PBS适用于做细胞缓冲液,经常使用PBS配制如下。
NaCl8g
KCl0.2g
Na2HPO41.44g
KH2PO40.24g
在800ml蒸馏水中溶解,用HCl调剂溶液的pH值至~加水定容至1L,15psi(1.05kg/cm2)高压灭菌20min,室温保留备用。
Tris缓冲液(Tris-HClBuffer,TB)
Tris的pH值偏于碱性,因此,通过添加HCl调剂pH至所需值,Tris-HCl缓冲液的离子强度(mol/L)是专指Tris的浓度,如某一特定pH的mol/LTris缓冲液的配制是将50mlmol/LTris碱溶液与附表3所示相应体积(ml)的mol/LHCl混合,加水至将体积100ml,即为mol/LTris缓冲液。
另外,按附表3制备的缓冲液,由于试剂来源的不同,缓冲液pH可能与所需略有不同,现在可通过稍许减少或增加HCl用量,精细调剂pH至所需值。
附表4.0.05mol/LTris缓冲液
需mol/LHCl(ml)
Tris盐缓冲液(TBS):
Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCl以维持溶液的渗透压,因此,TBS也适用于做细胞缓冲液,经常使用TBS配制如下。
8gNaCl、0.2gKCl和3gTris溶解于800ml蒸馏水中,加入0.015g酚红并用HCl调pH至用蒸馏水定容至1L,分装后在15psi(1.05kg/cm2)高压灭菌20min,室温保留。
此刻经常使用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂,而且该溶液若是不用于细胞培育,通常不加KCl及酚红。
Hank’s液(Hank’sBalancedSaltSolution)
Hank’s液是一种平稳盐溶液,要紧用于细胞培育取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。
贮存液A液:
(I)NaCl80g
KCl4g
MgSO4·
7H2O1g
MgCl2·
6H2O1g
用双蒸馏水定容至450ml。
(II)CaCl21.4g(或CaCl2·
2H2O1.85g)
用双蒸馏水定容至50ml。
将I和II液混合,即成A液。
贮存液B液:
Na2HPO4·
12H2O1.52g,
KH2PO40.6g,
酚红0.2g,
葡萄糖,
酚红应先置研钵内磨细,然后按配方顺序一一溶解,用双蒸馏水定容至500ml。
(3)应用液:
A、B贮存液别离经112.6℃湿热灭菌20min,取A和B液各25ml,加无菌双蒸馏水至450ml,利用前用无菌的%或%NaHCO3调至所需pH。
注意:
药品必需全数用试剂,并按配方顺序加入,用适量双蒸水溶解,待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品,最后补足水到总量。
无Ca2+、Mg2+Hank’s液(Hank’sSolutionwithoutcalcium,magnesiumsulfate)
NaCl80g,
KCl4g,
12H2O1.52g,
KH2PO40.6g,
葡萄糖10g,
用双蒸馏水溶解后,加入%酚红溶液50ml,再加入双蒸水至1000ml,112.6℃湿热灭菌20min,4℃冰箱保留。
临用前将原液用无菌双蒸水作1:
10倍稀释,用无菌的%或%NaHCO3调至所需pH。
柠檬酸盐缓冲液(CitrateBuffer)
柠檬酸0.327g
柠檬酸钠2.63g
磷酸氢钠
葡萄糖
蒸馏水加至100ml。
枸橼酸-磷酸盐缓冲液(Citricacid-PhosphateBuffer)
Lcitrateacid,LNa2HPO4,等量混合,调剂pH至。
mol/LEDTA,pH
EDTA·
2H2O186.1g
NaOH~20g
将EDTA·
2H2O加入800ml水中,在磁力搅拌器上猛烈搅拌。
用NaOH调剂pH至,EDTA直到接近pH才完全溶解,定容至1L。
分装后高压蒸汽灭菌。
%酚红溶液
取酚红置于研钵中逐滴加入1mol/LNaOH溶液,边研磨边使酚红转变成钠盐溶于水中,加双蒸水至100ml,过滤后,4℃冰箱保留。
醋酸钾(PotassiumAcetate)
在60ml5mol/L醋酸钾溶液中,加入冰醋酸和水。
该溶液用于碱性裂解。
3mol/L醋酸钠(SodiumAcetate),和
在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠,用冰乙酸调pH至或用稀释乙酸调pH至,加双蒸水至1L。
分装后高压灭菌。
柠檬酸钠缓冲液(SodiumCitrateBuffer)
柠檬酸钠1.8g
HCl(1mol)4ml
无水乙醇95ml
先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠,然后加入HCl和无水乙醇,再补充去离子水至总量200ml。
饱合硫酸铵溶液(SaturatedAmmoniumSulfateSolution)
取500ml双蒸馏水,加入约400克硫酸铵,水浴加热至70℃
,磁力搅拌器充分搅拌,直到加入的硫酸铵再也不溶解,以氨水(也可用NaOH)调,室温保留。
二、酶免疫检测经常使用试剂配制
包被液(CoatingBuffer)(碳酸盐缓冲液)
Na2CO3·
10H2O8.58g
NaHCO35.8g
溶于双蒸水至1000ml。
封锁液(Confiningliquid)(5%脱脂乳-PBS溶液,)
脱脂乳50g
加L磷酸盐缓冲液(PBS)至1000ml溶解。
洗液(washingliquid)
氯化钠8.0g
磷酸二氢钾0.2g
磷酸氢二钠(12H2O)2.9g
吐温-20
加去离子水至1000ml溶解即可。
终止液(stopbuffer)(2mol/LH2SO4):
H2SO4加去离子水至200ml。
缓冲甘油(glycerinebuffer)
甘油9份
PB()1份
将9份甘油与1份PB归并,充分混匀。
%H2O2-甲醇液(HydrogenPeroxide-MethanolSolution)(整体积120ml)
3%H2O220ml
甲醇100ml
DAB-H2O2底物缓冲液(DAB-H2O2SubstrateBuffer)
取6mg二氨基联苯胺(3,3’-DiaminobenzidineTetrahydrochlorideDAB)溶解于10mlTris-HCl。
利用前取%H2O2加入到DAB溶液中(H2O2的终浓度为%)。
如有沉淀生成,那么用滤纸过滤。
5-溴-4-氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液(BCIP/NBTSubstrateSolution)
贮存液配制:
NBT:
在10ml70%的乙醇中溶解0.5gNBT。
BCIP:
在10ml100%二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIP。
贮存液4℃保留,可稳固一年。
底物显色液:
取66μlNBT贮液与33μlBCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中,充分混匀,底物显色液应在用前1小时内配制。
三、细胞相关试剂配制
L-谷氨酰胺(L-G)溶液(L-glutaminSolution)(mol/L)
称2.9gL-谷氨酰胺(分子量为)用去离子水溶解至100ml,过滤除菌,分装小瓶,4~5ml/瓶,-20℃冻存。
100x青-链霉素(双抗)溶液(P/SPenicillin/StreptomycinSolution)
取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于100ml去离子水中,分装小瓶,4~5ml/瓶,-20℃冻存。
%NaHCO3溶液(NaHCO3Solution)
称分析纯NaHCO37.5g,用去离子水溶解至l00ml,过滤除菌,分装小瓶,4~5m1/瓶,盖紧瓶塞,4℃保留。
HEPES溶液(HEPESSolution)(1mol/L)
称23.83gHEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'
-2-ethanesulfonicacid,N-2-羟乙基呱嗪-N'
-2-乙基磺酸,分子量为),用去离子水溶解至100ml,过滤除菌,分装小瓶,4~5m1/瓶,4℃保留。
氨基喋呤(A)贮存液(AminopterinStockingSolution)(100×
4×
10-5mol/L)
称mg氨基喋呤(Aminopterin,分子量),溶于90m1去离子水中,滴加lmol/LNaOH0.5m1,并非断搅动,待氨基喋呤完全溶解后,加1mol/L的HCl0.5m1中和,再补加去离子水至100m1。
过滤除菌,分装小瓶,2ml/瓶,-20℃冻存。
次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液(HTStockingSolution)(100×
H:
10-2mol/L;
T:
×
10-3mol/L)
称取mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,分子量)和mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,分子量),加去离子水至l00ml,置45~50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶,2m1/瓶,-20℃冻存。
用前可置37℃加温助溶。
HAT培育液
培育液98ml,A贮存液1m1,HT贮存液lml。
秋水仙素溶液(colchicineSolution)
称取10mg秋水仙素,溶于100m1生理盐水中(即为100μg/ml),过滤除菌后,分装小瓶,-20℃冻存备用。
Alsever’s血细胞保留液(Alsever’sSolution)
葡萄糖2.05g,
柠橡酸钠0.8g,
NaCl0.42g,
蒸馏水l00ml。
以上成份混匀后,微加温使其溶解后,用柠檬酸调剂pH,分装于三角瓶中(30~50ml/瓶),113℃湿热灭菌15min,4℃保留备用。
细胞冻存液(FreezingMedium)
50%小牛血清;
40%不完全培育液;
10%DMSO(二甲基亚砜)。
%胰蛋白酶-%EDTA细胞消化液(Trypsin-EDTASolution)
A:
%胰蛋白酶:
胰蛋白酶2.5g
磷酸缓冲盐溶液100ml
过滤除菌保留。
B:
%二乙胺四乙酸二钠(EDTA)
EDTA0.2g
双蒸馏水100ml
高压灭菌保留。
取A液1份,加B液99份,混匀,分装-20℃保留。
%NH4CI溶液(AmmoniumChlorideSolution)
NH4CI0.83g
KHCO30.1g
2Na0.0037g
蒸馏水加至100ml。
Tris-NH4Cl溶液(Tris-AmmoniumChlorideSolution)
NH4Cl3.735g/450ml双蒸水+Tris1.3g/50ml双蒸水(pH)。
细胞裂解液(CellLysisSolution)
20mmol/LHEPES(pH
150mmol/LNaCl
1mmol/LEDTA
10μg/mlleupeptin
1mmol/LPMSF
1%TritonX-100
%deoxicholate(sodiumsalt)
%SDS
组织匀浆缓冲液(HistolysisBuffer)
50mmol/LTris-HCl
150mmol/LNaCl
1%NP40
1mmol/Lphenylmethylsulfonylfluoride
4μg/mlleupeptin
1μg/mlaprotinin
细胞核裂解液(NuclearLysisBuffer)
10mmol/LTris-HCl
10mmol/LEDTA
蛋白酶K100µ
g/ml
%SDS(最后加)
10mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)
在异丙醇中溶解PMSF至ml,即10mmol/L,分装后保留于-20℃,若是需要的话,可将贮存液制备至ml,即100mmol/L的高浓度。
闪烁液(ScintillationSolution)
PPO(2,5-二苯基)5.0g、POPOP(1,4-双-5-苯基)0.5g溶于1000ml二甲苯中。
也可将POPOP加入二甲苯,在37℃水浴上溶解后,再加PPO,然后补足二甲苯。
3H-TdR工作液(wokingSolution)
按1:
20的比例将浓度为1mCi/ml的3H-TdR用无血清的RPMI培育液稀释,终浓度为50µ
Ci/ml。
肝素溶液的配制:
含有肝素的培育液能够使内皮细胞纯度提高,肝素加入全培育液中最终浓度为50ug/ml。
因为此刻市售的多为肝素钠,包装为约为克/瓶,配制时,可将其溶于100ml三蒸水中,定容,留宿,然后过滤除菌,分装小瓶,保留温度为4℃。
利历时,向100ml培育液中加入1ml(精准可加入)即可。
Ⅰ型胶原酶:
%Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。
因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大,不容易过滤,因此能够用蔡式滤器过滤除菌。
分装入10ml小瓶-20℃保留。
历时提早一小时37℃复温即可.%的I型胶原酶的配置,100mg的粉末状的I型胶原酶能够溶于100ml的DMEM/F12,微米滤器过滤%的I型胶原酶的配置,100mg的粉末状的I型胶原酶能够溶于100ml的DMEM/F12,微米滤器过滤.
四、染色液配制(PreprationofStainingSolution)
苏木素液(HematoxylinSolution):
苏木素2.5g,乙醇,钾明矾2.5g,氧化汞1.25g,冰乙酸,蒸馏水。
配制方式是先将苏木素溶于乙醇中(略加热)。
将预先已溶解明矾的蒸馏水加入苏木素乙醇液中,使溶液尽快沸腾后,将火焰熄灭,慢慢加入氧化汞,避免溶液油溅出,再煮沸2min。
将烧瓶当即浸入冷水中,当染液冷却后,加入醋酸,室温保留,用前过滤。
伊红Y染色液(EosinYSolution)
伊红Y~1.0g,蒸馏水75ml,95%乙醇25ml,冰乙酸1~2滴。
先取少量蒸馏水加入伊红,用玻棒将伊红研碎,再加入全数蒸馏水,溶解后加入乙醇。
甲基绿染色液(MethylGreeenSolution)
新购买的甲基绿需用氯仿处置去除甲基紫。
方式是将2%甲基绿水溶液20ml倾入干净分液漏斗,移去慢慢下沉带紫红色的氯仿,再加入新的氯仿10ml,如此反复改换氯仿,到无紫红色为止。
该液作为贮存液,4℃保留。
染色液:
甲基绿贮存液5ml,5%派诺宁水溶液1ml,蒸馏水12ml,L乙酸钠18ml(临用前配制,滤纸过滤)。
吖啶橙贮存液(AcridineOrangeStockingSolution)
10mg吖啶橙溶解于100mlPBS中,~滤过,4℃避光保留。
吉姆萨贮存液(GiemsaSolution)
吉姆萨染色粉1g先溶于少量甘油,在研钵内研磨30min以上,至看不见颗粒为止,再将全数(66ml)剩余甘油倒入,于56℃温箱内保温2h。
然后再加入甲醇(66ml),搅匀后保留于棕色瓶中。
母液配制后放入冰箱可长期保留,一样刚配制的母液染色成效欠佳,保留时刻越长越好。
临历时用磷酸缓冲液稀释10倍,随配随用。
瑞氏染色液(Wright’sSolution)
瑞氏染色粉0.3g
甘油3ml
甲醇97ml
将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细,加入甘油继续研磨,不断滴加甲醇并继续研磨,将上层溶解的染料倒入棕色瓶中,直至染料全溶后加甲醇至所需量。
混匀后置棕色瓶中保留,用前过滤。
一般配制后置室温一周即可利用,保留时刻愈入,那么染色成效愈佳。
吉姆萨-瑞氏染色液(Giemsa-Wright’sStainingSolution)
瑞氏染色粉0.3g
吉姆萨染色粉0.03g
甲醇100ml
将二种粉末置于研钵中磨细,再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中,塞紧瓶口并充分振荡。
置室温溶解后利用。
噻唑兰(MTT)
称取250mgMTT,加50mlPBS(L,pH)在磁力搅拌器上搅拌30min,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,分装,4℃保留。
两周内有效。
台酚蓝染色液(TrypanBlueSolution)
A:
台酚蓝染料1g
蒸馏水100ml
将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。
B:
NaCl1.7g
临用前A、B液1:
1混合,离心沉淀,取上清供染色用。
混合后的染液寄存太久,易形成沉淀,故应新鲜配制。
染色时,取细胞悬液加入新鲜配制的染色液一滴,室温下染5~10分钟,取一滴悬液于载波片上,加盖玻片,高倍镜下检查。
死亡细胞膨大并染成浅蓝色,活细胞不着色,大小正常。
五、固定剂(Fixatives)
大多数神经激素、肽类物质为水溶性,在用于免疫细胞化学研究之前,常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同,因此对不同的固定方式或固定剂的反映也不同。
某些固定剂乃至可同时破坏和/或爱惜同一抗原的不同抗原决定簇。
因此,在进行免疫细胞化学研究之前,很有必要了解所要研究的物质(蛋白质或肽类)的化学性质,并依照需要来选择适宜的固定剂(或固定方式)和改良固定条件。
目前,免疫细胞化学研究中经常使用的固定剂仍为醛类固定剂,其中以甲醛类和戊二醛最为经常使用。
4%多聚甲醛L磷酸缓冲液,(formaldehyde-PhasphateBuffer)
多聚甲醛 40g
L磷酸缓冲液 至1000ml
配制方式:
称取40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500~800mlL磷酸缓冲液(PhosphateBuffer以下简称PB),加热至60℃左右,持续搅拌(或磁力搅拌)至完全溶解,通常需滴加少量1NNaOH才能使溶液清亮,最后补足L的PB于1000ml,充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究,最好是动物经灌注固定取材后,继续浸泡固定2~24h。
另外,该固定剂较为温和,适于组织标本的较长期保留。
4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠(formaldehyde-SodiumPhosphate/SodiumHydroxideBuffer)
A液:
多聚甲醛 40g
蒸馏水 400ml
B液:
2H2O
蒸馏水 300ml
C液:
NaOH
蒸馏水 200ml
配制方式:
A液最好在500ml的三角烧瓶中配制(方式同前),最多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意,在溶解多聚甲醛时,要尽可能幸免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后,将B液倒入C液中,混合后再加入A液,以1NNaOH或1NHCl将pH调至~,最后,补充双蒸水至1000ml充分混合,4℃冰箱保留备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究,用于免疫电镜时,最好加入少量新鲜配制的戊二醛,使其终浓度为%~1%。
该固定剂较温和,适于组织的长期保留。
组织标本于该固定液中,4℃冰箱保留数月仍可取得中意的染色成效。
六、蛋白电泳相关试剂
30%丙烯酰胺(Acrylmide)
丙烯酰胺29g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g
溶于60ml水中,加热至37℃溶解,补加水至终体积100ml。
µ
M滤器过滤除杂质,置深色瓶中室温保留。
考马斯亮蓝R-250染色液(CoomassieStainingSolution)
1.称取1g考马斯亮蓝R-250,置于1L烧杯中。
2.量取250ml的异丙醇加入上述烧杯中,搅拌溶解。
3.加入100ml的冰醋酸,搅拌均匀。
4.加入650ml的去离子水,搅拌均匀。
5.用滤纸除去颗粒物质后,室温保留。
考马斯亮蓝脱色液(DestainingSolution)
量取以下溶液,置于1L烧杯中,充分混合后利用。
醋酸100ml
乙醇50ml
dH2O850ml
1mol/L二硫苏糖醇贮存液(DTTStockingSolution)
用20mlL乙酸钠溶液()溶解,过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃保留。
DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处置。
LpH甘氨酸-
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