《DNA的复制和修复》Word格式.docx
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★复制起点的克隆和功能分析一一重组质粒转化法
大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样受到严密控制,每个细胞只有1-2个拷贝,用核酸外切酶缩短oriC克隆片段的大小,最后得到245bp的基本功能区,携带它的质粒依然能够自我复制,拷贝数可以增加到20以上,这说明发动复制的序列在245bp的基本功能区,而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和1Kb之间。
鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段296bp的DNA片段上,与大肠杆菌的复制起始区有86加源性,而且有些亲缘关系较远的细菌,其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。
因此,复制起始区的结构可能是很保守的。
起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。
2、复制单位
复制子(Replicon)Genom^独立进行复制的单位,每个复制子都含有一个复制起点。
原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子,它们都是单复制子,都在一个固定的起点开始复制,复制方向大多数是双向的,少数是单向复制。
多数是对称复制,少数是不对称复制(一'
条链复制后才进行另一条链的复制>
环状DNA的复制眼象0,称0形复制。
真核生物的染色体DNA是线形双链分子,含有许多复制起点,因此是多复制子,每个复制子约有100-200Kbp人体细胞平均每个染色体含有1000个复制子。
病蠹DNA多种多样,环状或线形,双链或单链,但都是单复制子。
3、复制方向
定点起始,复制方向大多数是双向的(等速进行或异速进行),形成两个复制义,少数是单向复制,形成一个复制义。
★用放射自显影实验判断DNA的复制方向及速度
低放射性3H-脱氧胸苜
高放射性3H-脱氧胸苜
a.单向
A
b.双向等速」三种结果图形
c.双向异速
E.coli.的一个温度敏感株,在42C时,能使DNA在完成复制后,不再开始新的复制过程,而在25C时复制功乂能能恢复。
4、DNA的几种复制方式
(1)、直线双向复制
单点,双向,T7
多点,双向,真核染色体DNA
(2)、0型复制:
环状双链DNA单向或双向(E.coli.)
(3)、滚环复制:
环状单链DNA①x174
(4)、D环复制:
线粒体、叶绿体DNA
(5)、多复制义复制:
第一轮复制尚未完成,复制起点就开始第二轮的复制。
在E.coli.富营养时,可采取多复制义复制方式oE.coli.DNA的复制最快可达50Kb/min,完全复制需40min,富营养时,20min分裂。
而真核染色体要6-8小时。
三、与DNA复制有关的酶及蛋白质因子
目前已发现30多种酶及蛋白质因子参与DNA复制
(1)DNA的聚合反应和聚合酶
DNA生物合成5t3,化学合成3t5
1、DNA聚合反应必备的条件
⑴DNA聚合酶
⑵DNA模板(反转录时用RNA模板)
⑶引物(DNA、RNA或蛋白质)
(4)4种dNTP
⑸Mg2+
2、聚合反应过程及特点
在链的延长过程中,链的游离3,-羟基,对进入的脱氧核糖核苜三磷酸c磷原子发生亲核攻击,生成3'
.5-磷酸二酯键,并脱下焦磷酸。
DNA聚合酶的反应特点:
⑴以4种dNTP为底物
⑵反应需要接受模板的指导,不能催化游离的dNTP的聚合。
⑶反应需有引物3-羟基存在
⑷链生长方向5t3
⑸产物DNA的性质与模板相同
3、由DNA聚合酶催化的几种DNA聚合类型
P331图19-12
(1)发英环结构:
加入单链DNA作为模板和引物,3羟基端回折成引物链。
(2)末端延伸聚合:
加入双链DNA作为模板和引物,3'
末端突出作为模板。
(3)分枝型和切口平移型聚合:
加入双加NA,聚合发生在切口或末端单链区。
(4)环形聚合:
加入带引物的环形DNA作为模板。
4、E.coliDNA聚合酶
(1)、E.coli.DNApol.I(Kornberg酶,400copy/cell)
单体酶,分子量109Kd,含一个Zn2+,每个细胞中含400个DNApol.I
催化活性:
5t3聚合活性
3t5外切活性
5T3外切活性
用蛋白水解酶将DNApol.I部分水解可得:
大片段(Klenow),75Kd,活性:
5,-3'
聚合活性、3-5'
外切活性。
小片段,36Kd,活性:
5t3'
外切活性(只作用于双链DNA的碱基配对部分,切除修复》
Klenow片段的用途:
a补齐DNA3'
隐缩未端
b.标记DNA片段未端
c.cDNA合成第二链
d.dDNA测序
(2)、E.coli.DNAPol.n(100copy/cell)
单体酶,分子量120Kd
5—3聚合(活性很低)
3'
t5'
外切
可能在DNA的修复中起某中作用。
(3)、E.coli.DNApol.用(复制酶,10-20copy/cell)
寡聚酶,全酶由10种共22个业基组成,a、£
和0三种业基组成核心酶。
P334表10-3
DNApol皿是合成新链DNA主要的酶,乂称复制酶Replicase)
Pol皿的5'
t3外切酶活性只作用于单链DNA。
P334表19-2E.coli三种DNA聚合酶的性质比较
★DNA聚合酶有6个结合位点
⑴棋板DNA结合位点
⑵引物结合位点
⑶引物3'
-OH位点、反应位点
⑷底物dNTP结合位点
⑸5t3'
外切位点(pol』没有)
(6)3t5外切位点(校正)
5、真核生物DNA聚合酶
P334表19-4真核生物DNA聚合酶
真核DNA聚合酶一般不具备外切活力,可能由另外的BWDNA复制中起校正功能
(1)DNA聚合酶a,多业基,功能与E.coli.po皿类似,是真核DNA复制酶。
⑵DNA聚合酶6,主要在DNA损伤的修复中起作用。
⑶DNA聚合酶丫,从线粒体得到,可能与线粒体DNA的复制有关。
⑷DNA聚合酶a,特点:
有3'
t5'
外切活力。
(二)引物酶或RNA聚合酶(引发酶)
细胞内,DNA的复制需要引物(DNA或RNA),引物酶或RNA聚合酶可合成6-10个碱基的RNA弓|物。
★DNA复制为什么要用RNA引物?
(为什么DNA聚合酶要用引物,RNA聚合酶不需要引物?
)
P338
⑴从棋板复制最初几个核酸时,碱基堆集力和氢键都较弱,易发生错配
⑵新复制的最初几个核苜酸,没有与棋板形成稳定双链,DNA聚合酶的5,校对功能难发挥作用。
(三)解螺旋酶
大肠杆菌的解螺旋酶I、U、m与rep蛋白共同作用,将DNA两条链解开。
解螺旋酶I、II、III沿着棋板链的5'
t3'
方向随着复制义的前进而移动,而rep蛋白则在另一条棋板链上沿3'
t5'
方向移动。
(四)DNA旋转酶
届DNA拓扑异构Wn,可引入负超螺旋,消除复制义前进时带来的扭曲张力。
拓扑异构酶分两类:
I和II,广泛存在于原核生物和真核生物。
拓扑异构酶I使DNA的一条链发生断裂和再连接,反应无须供给能量,主要集中在活性转录区,与转录有关。
拓扑异构酶II使DNA的两条链同时断裂和再连接,当它引入超螺旋时需要曲TP供给能量。
分布在染色质骨架蛋白和核基质部,与复制有关。
(五)单链DNA结合蛋白(SSB)
复制义上的解螺旋酶,沿双链DNA前进,产生单链区,大量的单链DNA结合蛋白与单链区结合,阻止复性和保护单链DNA不被核酸酶降解。
(六)DNA连接酶(ligase)
连接双链DNA上的切口。
大肠杆菌连接酶只能在棋板上连如NA缺口。
T4DNAligas攻口可连接粘性末端的DNA,乂可连接平齐末端的双链DNA。
E.coli和其它细菌的DNAligaseNAD为能源,动物细胞和噬菌体DNAligas四ATP为能源
P338-339
四、DNA的半不连续复制
P336图19-15DNA的半不连续复制
DNA聚合酶催化的方向是5'
。
前导链:
滞后链:
1968年,发现冈崎片段。
长度:
细菌:
1Kb-2Kb,相当于一个顺反子的大小。
真核:
100-200bp约等于一个核小体DNA的长度。
五、DNA复制过程(E.coli)
P342图19-17大肠杆菌的复制体结构示意图
1、复制的起始
引发:
当DNA的双螺旋解开后,合成RNA引物的过程。
引发体:
引物合成酶与各种蛋白质因子dnaBdnaGn、Xn7/I)构成的复合体,负责RNA引物的合成。
引发体沿着棋板链5'
方向移动(与冈崎片段合成的方向正好相反,而与复制义移动的方向相同),移到一定位置上即可引发RNA引物的合成。
E.coli.DNA复制原点oriC,由245bpffl成,三组13bp重复序列(近5'
端处),四组9bp重复序列(另一端处)。
大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质:
DNaA
DNaB
DNaC
Hu
引物酶(DNaG)
SSB
RNA聚合酶
在原点处打开双螺旋
使DNA解旋
DNaB结合在原点所需
刺激起始
合成RNA引物
结合单链DNA
促进DNaA活性
旋转酶松驰DNA扭曲应力
20个DnaA结合在四组9bp重复区,形成起始复合物,DNA环绕此复合物。
三组13bp重复区依次变性,产生开放型复合物。
DnaB(在DnaC协助下)与开放复合物结合,进一步解链。
2、DNA链的延长反应
前导链只需要一个RNA引物,后随链的每一个冈崎片段都需要一4RNA引物,链的延长反应由DNApol.m催化。
复制体:
在DNA合成的生长点(既复制义上)分布着许多与复制有关的酶和辅助因子,它们在DNA的棋板链形成离散的复合物,彼此配合进行高度精确的复制,称为复制体。
复制体沿着复制义方向前进就合成DNA。
3、RNA引物的切除及缺口补齐
DNApoll的5'
t3'
外切活力,切除RNA引物。
DNApolI的5'
合成活性补齐缺口。
4、DNA切口的连接
DNAligase动物、真核由ATP供能,原核由NAD供能。
5、DNA合成的终止
环状DNA、线性DNA,复制义相遇即终止。
小结:
⑴DNA解螺旋酶解开双链DNA。
(2)SSB结合于DNA单链。
⑶DNA旋转酶引入负超螺旋,消除复制义前进时带来的扭曲张力。
⑷DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。
⑸DNApol皿在两条新生链上合成DNA。
(6)DNApoll切除RNA引物,并补上DNA。
⑺DNAligase®
接一个冈崎片段。
DNA复制过程中,聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高有少量dUTP掺入DNA链中,此时,U-糖苜酶、AP内切酶、DNApoll、DNAligase^同作用,切除尿嚅噬,接上正确的碱基。
六、真核生物DNA的复制P343
1、复制起点和单位
真核生物染色体DNA是多复制子,有多个复制起点,可以多点起始,分段进行复制。
每个复制子大多在100-200b必问,比细菌染色体DNA(单复制子)小得多。
★试验证据:
5-氟脱氧胞苜标记
真核生物DNA复制义移动的速度此原核的慢,如哺乳动物复制义移动的速度每分铀-3Kb,细菌每分钟5Kb。
真核生物染色体全部复制完成前,起点不再从新开始复制。
而在快速生长的原核生物中,起点可以连续发动复制。
真核生物在快速生长时,可采用更多的复制起点同时复制。
如黑腹果蝇,早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为7.9k。
而在培养的成体细胞中,平均距离iM0kb,成体细胞只利用一部分复制起点。
2、复制过程中组蛋白的装配
核小体的结构(200bp左右)
在真核生物的复制子上,亲代染色体的核小体被逐个打开,组蛋白以完整的八聚体形式直接转移到子代DNA的前导链上,新合成的组蛋白与后随链组装成核小体。
因此DNA的复制是半保留的,而组蛋白则是全保留的。
环己酮业胺抑制组蛋白合成,电子显微镜下观察
3、真核生物DNA复制的终止
端粒:
一段DNA序列与蛋白质形成的一种复合体,是真核细胞染色体末端所特有的结构。
功能:
⑴保证线性DNA的完整复制
⑵保护染色体末端
⑶决定细胞寿命,胚系细胞含端粒酶,体细胞不表达端粒酶。
端粒(telomere^分布于线性真核染色体未端。
酵母端粒约100bp的重复序歹0,形式为:
5'
(TxGy)n3'
(AxCy)n,x和y一般为1—4。
端粒末端的重复序歹0,通过端粒酶telomerase将其加到染色体末端。
端粒酶含有RNA和蛋白质(起DNA聚合酶的作用)两种组分,RNA分子约159。
含有多个CyAx重复序列,RNA分子用作端粒TxGy链合成的棋板。
端粒酶是一种反转录酶,它只合成与酶自身白RNA棋板互补的DNA片段。
人类体细胞的端粒长度,随个体年龄增加而逐渐缩短。
细胞每分裂一次,端粒缩短50-200bp短至1-4Kbp时,细胞就停止分裂。
若能重建端粒,则细胞可以永远分裂。
恶性肿瘤细胞端酶表达多。
⑴杂交
⑵聚合图
⑶转位再杂交
⑷进一步聚合
⑸非标准GG配对
七、DNA复制的调控八、DNA复制的真实性
《杨岐生〉〉P144
生物体DNA复制具有高度真实性,复制1C7-1011碱基对,只有一个错误碱基。
碱基对的自由能通常在4-13KJ/mgl这样的自由能相当于平均参入100个核苜酸就可能出现一次错配,仅靠Watson-CriclK螺旋的碱基配对原则,突变率将高达0「2。
1、DNA聚合酶对碱基的选择作用
酶的被动论:
不同的核苜酸在聚合位点停留时间不同,正确的dNTP能长时间停留,而参与聚合。
DNA聚合酶能依照棋板的核苜酸,选择正确的dNTP掺入引物末端。
酶积极参与理论:
DNA聚合酶对正确与错误的核苜酸,不仅亲和性不同,而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。
动力学校正阅读:
在新的磷酸二酯键未形成时,dNTP结合在酶与棋板一引物复合物的聚合位点上DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP。
DNA聚合酶对底物的识别作用,DNA聚合酶有两种底物,一种是DNA棋板一引物,另一种是dNTP。
DNA聚合酶先识别DNA棋板和引物的3'
未端,再识别底物dNTP,是一种有序的识别过程。
2、3^5外切活性的校正阅读
E.coli.DNApoII和pol皿有3'
t5外切活性,可删除错误插入的核苜酸。
缺失3t5'
外切活性的E.coli.DNApoll,催化DNA合成时,出现错误的几率增高5-50倍。
因此,3tS外切活性可以使DNA复制的真实性,提高1-2个数量级。
3、影响DNA合成真实性的因素
⑴高浓度NMP(如3-AMP,5-GMP)
NMP竞争酶的dNTP结合位点,抑制3'
t5外切活性。
⑵某一种dNTP浓度银高,可使引物3'
末端离开外切活性中心。
⑶dNTP一股与二价阳离子结合成活化形式,Mg2+为主要的二价阳离子。
当用其它二价阳离子(如Mn2+)代替Mg2+W,会改变酶的主体结构,影响聚合活性袍^3,外切活性。
4、为什么用RNA引物
⑵新复制的最初几个核苜酸,没有与棋板形成稳定双链,DNA聚合酶的53校对功能难发挥作用。
第二节DNA的损伤及修复
DNA的损伤,《罗纪盛〉〉P428
一些物理化学因子如紫外线、电离辐射和化学诱变剂均可引JDNA损伤,破坏其结构与功能。
然而在一定条件下,生物机体能使这种损伤得到修复。
紫外线可使DNA分子中同一条链上两个相邻的胸腺嚅噬碱基之间形成二聚体TT),两个T以共价键形成环丁烷结构。
CT、CC问也可形成少量二聚体©
T、CC),使复制、转录受阻。
P346图19-22
细胞内具有一系列起修复作用的酶系统,可以除去DNA上的损伤,恢复DNA的双螺旋结构。
目前已知有4种酶修复系统:
光复活、切除修复、重组修复、SOS反应诱导的修复,后三种不需要光,乂称为暗修复。
一、光复活
1949年已发现光复活现象,可见光(最有效400nm可激活光复活酶,此酶能分解由于紫外线形成的嚅噬二聚体。
高等哺乳动物没有此酶。
P347图19-23紫外线损伤的光复活过程
A形成嚅噬二聚体B.光复合酶结合于损伤部位C酶被可见光激活D.修复后释放酶
二、切除修复
P348图19-24DNA损伤的切除修复过程
在一系歹0酶的作用下,将DNA分子中受损伤部分切除,并以完整的那一条链为棋板,合成出切去部分,
DNA恢复正常结构
I、结构缺陷的修复:
(1)核酸内切酶识别DNA损伤部位,在其附近将其切开。
(2)核酸外切酶切除损伤的DNA。
(3)DNA聚合酶修复。
(4)DNA连接酶连接。
II、无喋吟无口密噬碱基缺陷或错配脱碱基N-糖苜酶):
甲基磺酸甲酯可使鸟喋吟第7位氮原子烷基化,活化6一糖苜键,造成脱喋吟作用;
酸也能使DNA脱喋吟。
DNA复制时,DNA聚合酶对dTTP和dUTP分辨力不高,有少量dUTP掺入DNA链。
细胞中的尿嚅噬-N-糖苜酶可以切掉尿嚅噬。
腺喋吟脱氨形成次黄喋吟时也可以被次黄喋喙新苜酶切掉次黄喋吟。
对于无喋吟无嚅噬的损伤有两种修复方法:
(1)AP核酸内切酶切开,核酸外切酶切除,DNA聚合酶修复,DNA连接酶连接。
(2)插入酶插入正确碱基
三、重组修复
P349图1卜25重组修复的过程
切除修复发生在DNA复制之前,而当DNA发动复制时尚未修复的损伤部位,可以先复制,再重组修复。
在重组修复过程中,DNA链的损伤并未除去。
重组修复至少需要4种酶组分。
重组基因recA编码一种分子量为40000勺蛋白质,它具有交换DNA链的活力°
RecA蛋白被认为在DNA重组和重组修复中均起关键作用。
recEkrecC基因分别编码核酸外切酶V的两个业基。
此外,修复合成还需要DNA聚合酶和连接酶。
四、诱导修复和应急反应(SOS反应)
诱导修复是细胞DNA受到严重损伤或DNA复制系统受到抑制的紧急情况下为求得生存而出现的一系列诱导性修复。
SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复(无差错修复)和倾向差错的修复。
避免差错的修复:
SOS反应能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生从而加强光复活切除修复和重组修复的能力,这届于避免差错的修复。
倾向差错的修复:
SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶,它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡,可是却带来了高的突变率,这届于倾向差错的修复。
SOS反应是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。
RecA蛋白不仅在同源重组中起重要作用,而且它也是SOS反应的最初发动因子。
在有单链DNA和ATP存在时,RecA蛋白被激活而表现出蛋白水解酶的活力,它能分解入噬菌体的阻遏蛋白和LexA蛋白。
LexA蛋白(22Kd)许多基因的阻遏物,当它被RecA的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基ISVrA、uvrB、uvrC(分别编码核酸内切酶的业基)以及recA和lexA基因本身,还有单链结合蛋白基因ss。
与入噬菌体DNA整合有关的基因himA、与诱变作用有关的基因umuDC,与细胞分裂有关的基因sulA,ruv,和lon,以及一些功能不活楚的基因dinA,B,D,F等。
SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物,它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。
然而癌变有可能也是通过SOS反应造成的,因为能引起SOS反应的作用剂通常都具有致癌作用,女队-射线,紫外线,烷化剂,黄曲霉素等,而某些不能致癌的诱变剂并不引起OS反应,如5-漠尿嚅噬。
目前,有关致癌物的一些简便检测方法就是根脂OS反应原理而设计的,既测定细菌的SOS反应。
第三节RNA指导的DNA合成(反转录)
反转录(reversetranscription:
以RNA为棋板,合成DNA。
与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。
1970年,Temin和Baltimore^别从致癌RNA病蠹(劳氏肉瘤病蠹和鼠白血病病蠹)中发现发反转录酶。
致癌RNA病蠹是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病蠹。
这类病蠹侵染细胞后并不引起细胞死亡,却可以使细胞发生恶性转化。
经过改造后可以作为基因治疗的载体。
放线菌素D(抑制以DNA为棋板的反应,复制和转录)能抑制致SRNA病蠹的复制,可见致癌RNA病蠹的复制过程必然涉及DNA。
Bader用喋吟霉素(puromycii)来抑制静止细胞蛋白质的合成,发现这种细胞仍能感
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