高中生物《培养基无菌实验操作及实验结果》导学案+课后练习题Word文件下载.docx
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(3)平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,将平板倒置,可防止皿盖上的水珠落入培养基,造成污染。
(4)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间,否则此培养基不能用来培养微生物,因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
知识点二 纯化大肠杆菌
1.菌落的概念
由一个微生物细胞繁殖而来的肉眼可见的
子细胞群体,就是菌落。
2.纯化大肠杆菌的原理
在培养基上得到由
一个细胞繁殖而来的肉眼可见的
菌落,即获得较纯的菌种。
3.微生物接种常用的方法
(1)平板划线法
①概念:
通过接种环在琼脂固体培养基表面
连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②操作步骤
③注意事项
a.第一次划线及每次划线之前都需
灼烧接种环灭菌,划线操作结束仍需灼烧接种环。
第一次划线前灼烧:
杀死接种环上
原有的微生物。
每次划线之前灼烧的目的:
杀死
上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。
划线结束灼烧的目的:
杀死接种环上残存的菌种,避免细菌污染
环境和感染
操作者。
b.灼烧接种环之后,要等其
冷却后才能伸入菌液,以免温度太高杀死菌种。
c.在做第二次以及其后的划线操作时,总是从上一次划线的
末端开始划线,这样才能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
d.划线时最后一区域不要与
第一区域相连。
e.划线用力要大小适当,防止用力过大将
培养基划破。
(2)稀释涂布平板法
将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到
琼脂固体培养基的表面,进行培养。
当稀释倍数足够高时,即可获得单个细菌形成的
菌落。
②操作过程包括
系列稀释和
涂布平板。
③操作步骤
A.系列稀释操作步骤:
a.将分别盛有9mL水的6支试管灭菌,并按101~106的顺序编号。
b.用移液管吸取1mL培养的菌液,注入101倍稀释的试管中。
用手指轻压移液管上的橡皮头,吹吸三次,使
菌液与水充分混匀。
c.从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液,注入102倍稀释的试管中,重复第2步的混匀操作。
依次类推,直到完成最后一支试管的稀释。
注意:
移液管需要经过
灭菌。
操作时,试管口和移液管应在离火焰1~2cm处。
B.涂布平板操作步骤:
a.涂布器消毒:
将
涂布器浸在盛有
酒精的烧杯中消毒。
b.取菌液:
取少量菌液(不超过0.1mL),滴加到培养基表面。
c.涂布器灭菌:
将沾有少量酒精的涂布器在
火焰上引燃,待酒精燃尽后,冷却8~10s。
d.涂布平板:
用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。
涂布时可转动培养皿,使菌液分布均匀。
④注意事项:
a.消毒时将涂布器末端浸在盛有
体积分数为70%的酒精的烧杯中。
取出时,要让多余的酒精在烧杯中
滴尽,然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
b.操作中一定要注意防火!
不要将
过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中,以免引燃其中的酒精。
4.接种成功的标准
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致,并符合大肠杆菌菌落的特点,则说明接种操作是
符合要求的;
如果培养基上出现了其他菌落,则说明接种过程中,无菌操作还未达到要求,实验
失败,需要分析原因,再次接种。
5.菌种的保藏
(1)目的:
保持菌种的纯净,降低微生物的新陈代谢速率,延缓菌种衰老。
(2)方法
比较项目
临时保藏
甘油管藏
适用范围
频繁使用的菌种
长期保存的菌种
培养基
固体斜面培养基
液体培养基
保藏温度
4℃
-20℃
具体方法
接种到
固体斜面培养基上→适宜温度下培养→
4_℃冰箱中保藏
甘油瓶中装入甘油后
灭菌→将菌液转移至甘油瓶中→混匀后冷冻箱中保存
优缺点
甘油管藏法可以长时间保存菌种,临时保藏法保存时间短,菌种容易被污染或产生变异
1.在纯化大肠杆菌操作中,如何验证培养基灭菌是否彻底?
将接种后的培养基和一个未接种的培养基,都放在37℃恒温箱中培养,观察并记录结果。
2.如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落,你认为是由什么原因造成的?
培养基灭菌不彻底或接种过程中感染了杂菌。
3.稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键,决定稀释倍数和划线次数的因素是什么?
菌液的浓度。
题型二 正确区分平板划线法和稀释涂布平板法
[例2] 下面四种菌落分布图中,不可能是用稀释涂布平板法得到的是( )
解题分析 对微生物的分离常用稀释涂布平板法和平板划线法进行接种,将不同稀释度的菌液用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养,这一过程是稀释涂布平板法。
据图分析:
A、B、C属于稀释涂布平板法接种得到的平板,D平板有明显的划线痕迹,是平板划线法接种得到的平板。
答案 D
[例3] 下列关于微生物接种的描述,正确的是( )
A.平板划线法只用于固体培养基的接种,而稀释涂布平板法只用于液体培养基的接种
B.平板划线法的操作相对简单一些
C.利用平板划线法不能得到单菌落,而利用稀释涂布平板法能得到单菌落
D.平板划线法所用的接种工具不需要灭菌,而稀释涂布平板法所用的接种工具需要灭菌
解题分析 这两种方法都用于固体培养基的接种,都能用于形成单菌落,接种工具都要进行严格灭菌处理。
答案 B
题后归纳
比较平板划线法和稀释涂布平板法的异同点
题型三 正确理解大肠杆菌纯化中的“多次划线”与“充分稀释”[例4] 平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。
下列相关叙述错误的是( )
A.平板划线法要求在培养基表面连续划线,且除第一次划线外,每一次划线的起点都是上一次划线的末端
B.除第一次划线前需要将接种环灼烧灭菌外,以后的划线可以不用灭菌即可划线
C.如果菌液本来浓度不高,则可以适当降低稀释倍数
D.“充分稀释”和“连续划线”的目的都是获得由单一细胞繁殖而成的菌落
解题分析 在平板划线法中,连续划线的目的就是使菌种的浓度降低,所以除第一次划线外,以后的每次划线的起点都是上一次划线的末端,A正确;
将接种环灼烧灭菌并冷却后沾取菌液进行第一次划线,以后的每一次划线前都要将接种环进行灼烧灭菌,B错误;
稀释倍数要随菌液的浓度而定,如果菌液的浓度太大,则需要更高的稀释倍数,如果菌液本来浓度不高,就可以适当降低稀释的倍数,C正确;
稀释涂布平板法中的“充分稀释”及平板划线法中的“连续划线”,目的都是获得由单一细胞繁殖而成的菌落,D正确。
平板划线法中的主要操作要领是“多次划线”,稀释涂布平板法中的主要操作要领是“充分稀释”,二者虽然操作方法不同,但目的是一样的,即获得由单个细胞增殖而成的菌落。
如果平板划线法中的划线次数太少或稀释涂布平板法中的稀释倍数不够,则得到的可能是由多个细胞增殖而来的子细胞群体,其中还可能掺杂着其他杂菌,达不到纯化的目的。
课堂小结
当堂检测——查漏补缺 巩固提升
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( )
A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
答案 C
解析 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,应先根据需要计算各成分用量,然后称量、溶化、灭菌、倒平板,C正确。
2.纯化大肠杆菌的步骤正确的是( )
A.样品稀释→涂布法分离→培养成单菌落
B.样品稀释→培养成单菌落→划线或涂布法分离
C.样品稀释→划线或涂布→分离→培养成单菌落
D.样品稀释→划线→涂布→分离→培养成单菌落
解析 微生物的分离与纯化主要有平板划线法和稀释涂布平板法,其中稀释涂布平板法包括样品稀释、涂布及培养三个基本步骤,其中划线或涂布法是对微生物进行分离,培养是将分离后的菌种培养成单个菌落。
3.现有菌液10mL,按下图进行系列稀释,在最后一个试管中测得细菌数为20个,则未稀释前的试管中有细菌( )
A.600个B.1200个C.2×
107个D.2×
106个
解析 从本题的图中可看出,每次都是稀释10倍,总共稀释6次,即稀释106倍,最后一个试管为20个,即原来菌液中应该有细菌2×
107个,C正确。
4.将平板倒置的目的是( )
A.接种时再拿起来方便
B.在皿底上标记日期等方便
C.正着放置容易破碎
D.防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
解析 平板倒置主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染,D正确。
5.为了获得纯度高的大肠杆菌,需要对大肠杆菌进行培养和分离。
培养大肠杆菌一般用牛肉膏蛋白胨固体培养基。
(1)培养大肠杆菌,配制固体培养基的基本步骤:
计算→称量→________→________→倒平板。
(2)称量时,由于牛肉膏比较黏稠,可以用________挑取,放在__________上称量。
由于牛肉膏和蛋白胨____________,称量时动作要迅速,称量后要及时盖上瓶盖。
(3)在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的大肠杆菌能生长,说明培养基含有________________________等大肠杆菌生长所需的营养要素。
(4)微生物纯化培养可以通过多种接种方法如______________和______________________等,使大肠杆菌在固体培养基上形成单个________,从而获得纯菌株。
答案
(1)溶化 灭菌
(2)玻璃棒 称量纸 容易吸潮
(3)碳源、氮源、无机盐、水
(4)平板划线法 稀释涂布平板法 菌落
解析
(1)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的基本步骤:
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
(2)称量时,牛肉膏可用玻璃棒挑取,放在称量纸上称量,由于牛肉膏和蚕白胨容易吸潮,称量时动作要迅速,防止其吸收太多水分造成误差,称量后要及时盖上瓶盖防止瓶中吸潮或被污染。
(3)牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有大肠杆菌所需要的碳源、氮源、无机盐、水等营养要素,所以常用来培养大肠杆菌。
(4)微生物纯化培养的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法,可使大肠杆菌在固体培养基上形成单个菌落,从而获得纯菌株。
[基础对点]
1.在培养基的配制过程中,具体有如下步骤,其正确顺序为( )
①溶化 ②调pH ③加棉塞 ④包扎 ⑤分装
⑥称量
A.①②⑥⑤③④B.⑥①②⑤③④
C.⑥①②⑤④③D.①②⑤④⑥③
解析 上述步骤中,培养基的配制顺序为称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→包扎,B正确。
2.下列有关倒平板操作的叙述,错误的是( )
A.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上
B.使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰
C.将培养皿打开,培养皿盖倒放在桌面上
D.等待平板冷却凝固后需要倒过来放置
解析 整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵,因此灭过菌的培养皿应放在火焰旁,A正确;
打开的锥形瓶瓶口应迅速通过火焰,B正确;
培养皿应打开一条稍大于瓶口的缝隙,而不能将培养皿盖完全打开,C错误;
平板冷却凝固后需要倒过来放置,D正确。
3.下列关于制备牛肉膏蛋白胨培养基的叙述,错误的是( )
A.培养基应先调pH再进行灭菌
B.培养基应先灭菌再分装到培养皿
C.熔化琼脂时要不断用玻璃棒搅拌
D.使用高压蒸汽灭菌锅时直接将灭菌锅密封加热
解析 把灭菌锅内的水加热煮沸,将其中原有的冷空气彻底排出后,将锅密闭,继续加热使锅内气压逐步上升。
4.下列有关平板划线接种法的操作错误的是( )
A.将接种环放在火焰上灼烧
B.将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液
C.沾取菌液和划线要在火焰旁进行
D.接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连
解析 为了避免杂菌污染,沾取菌液和划线要在火焰旁进行,C正确;
每次划线之前都需灼烧灭菌,划线操作结束仍需灼烧接种环,A正确;
灼烧接种环之后,要冷却后才能伸入菌液,以免温度太高,杀死菌种,B正确;
在平板划线时不要将最后一区的划线与第一区相连,D错误。
5.如图为纯化大肠杆菌的一个操作环节,下列相关叙述中,错误的是( )
A.该操作步骤是接种,方法是平板划线法
B.除第一次划线外,以后的每一次划线的起点是上一次划线的末端
C.图中细菌密度最小的是5处
D.每次划线前要用酒精灯灼烧接种环,接着进行下次划线
解析 每次划线前都要灼烧接种环灭菌,然后等其冷却后进行下次划线,D错误。
6.稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。
A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
解析 若菌液浓度过大,形成的菌落连在一起,得不到单个的菌落,C错误。
7.下图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图,据图分析不正确的是( )
A.获得图A效果的接种方法是稀释涂布平板法
B.获得图B效果的接种方法是平板划线法
C.若在纯化土壤细菌时菌液浓度过高,培养基上的菌落可能会连成一片
D.在接种前要对培养基进行消毒处理
解析 在接种前要对培养基进行高压蒸汽灭菌处理,D错误。
8.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是( )
A.对比观察培养基有没有被微生物利用
B.对比分析培养基是否被杂菌污染
C.没必要放入未接种的培养基
D.为了下次接种时再使用
解析 对未接种的培养基进行培养,起到对照作用,可确定培养基是否被杂菌污染,B正确。
9.利用稀释涂布平板法纯化的大肠杆菌,经培养后发现培养基上出现了多种菌落,不可能的原因是( )
A.培养基制备过程中被杂菌污染
B.接种过程中,无菌操作不符合要求
C.系列稀释时,无菌操作不符合要求
D.大肠杆菌的种类不同
解析 大肠杆菌培养基中出现了多种菌落,说明污染了杂菌,杂菌可能来自培养基,也可能是因为操作过程中无菌操作不符合要求,A、B、C正确;
大肠杆菌就是一种类型的细菌,因此不会导致培养基上出现多种菌落,D错误。
知识点三 菌种保藏
10.为了保持菌种的纯净需要进行菌种的保藏,下列有关叙述不正确的是( )
A.对于频繁使用的菌种,可以采用临时保藏的方法
B.临时保藏的菌种一般是接种到试管的斜面培养基上
C.临时保藏菌种容易被污染或产生变异
D.对于需要长期保存的菌种,可以采用低温4℃保藏的方法
解析 低温4℃保藏属于临时保藏的方法,而对于需要长期保存的菌种,需放在-20℃的冷冻箱中保存,D错误。
[能力提升]
11.做“微生物的分离与培养”实验时,下列叙述正确的是( )
A.高压灭菌加热结束时,打开放气阀使压力表指针回到零后,开启锅盖
B.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上
C.为了防止污染,接种环经火焰后应趁热快速挑取菌落
D.用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上
解析 高压灭菌加热结束,等待压力表指针回到零后,才能开启锅盖,不能打开放气阀使压力表指针回到零,A错误;
倒平板过程中培养皿的皿盖打开一个稍大于瓶口的缝隙即可,B错误;
接种环火焰上灼烧后,待冷却后才可以快速挑取菌落,C错误;
用记号笔标记培养皿中菌落时,应标记在皿底上,D正确。
12.下图是实验室使用某种接种方法在培养基上培养某种微生物的结果,相关说法错误的是( )
A.该图最可能是用稀释涂布平板法进行接种的
B.在操作时,为防止杂菌污染,需进行严格的消毒和灭菌
C.恒温培养箱中培养时需要将平板倒置
D.该接种方法常用于微生物的分离纯化
解析 培养基上微生物的分布有疏有密,应为平板划线法接种,该接种方法常用于微生物的分离纯化,A错误,D正确;
在操作时,为防止杂菌污染,应对培养基和接种针等进行灭菌,对操作空间、衣着和手进行消毒,B正确;
恒温培养箱中培养时需要将平板倒置,防止冷凝水滴在培养基上,C正确。
13.科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白,这种蛋白质具有极强的抗菌能力,受到研究者重视。
(1)可用金黄色葡萄球菌来检验该蛋白质的抗菌特性。
抗菌实验中所用培养基中的牛肉膏和蛋白胨主要为细菌生长提供________和________。
(2)分别在加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中接种等量菌液。
培养一定时间后,比较两种培养基中菌落的________,确定该蛋白质的抗菌效果。
(3)细菌培养常用的接种方法有________和________________。
实验结束后,对使用过的培养基应进行________处理。
答案
(1)碳源 氮源
(2)数量和大小
(3)平板划线法 稀释涂布平板法 灭菌
解析
(1)牛肉膏和蛋白胨都是天然培养基成分,含有丰富的蛋白质、糖类等营养成分,可以为微生物的生长提供碳源和氮源以及生长因子。
(2)通过对比加入和未加入该抗菌蛋白的培养基中细菌菌落的数量和大小,确定该蛋白质的抗菌效果。
(3)在培养细菌时,往往采用平板划线法和稀释涂布平板法进行接种;
操作过程中用完的培养基都要进行灭菌处理,以防止污染环境和对人造成感染。
14.下表是培养某微生物的培养基的配方,请回答下列问题:
试剂
牛肉膏
蛋白胨
NaCl
琼脂
加水定容至
用量
5g
10g
20g
1000mL
(1)培养基的类型很多,但培养基中一般都含有水、碳源、________和无机盐。
上述培养基配方中能充当碳源的成分是____________________。
培养基配制完成以后,一般还要调节pH并对培养基进行________处理。
(2)微生物在生长过程中对各种成分的需要量不同,配制培养基时各成分要有合适的________。
在烧杯中加入琼脂加热时要不停地________,防止______________________。
(3)将配制好的培养基分装到试管中,加棉塞后,若干个试管一捆,包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入________________中灭菌,压力为________kPa,温度为________,时间为________。
灭菌完毕拔掉电源,待锅内压力自然降到0时,将试管取出。
如果棉塞上沾有培养基,此试管应________。
(4)使用高压蒸汽灭菌锅时应注意,先向锅内倒入________。
把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后,将锅密闭。
(5)从一支试管向另一支试管接种时应注意,接种环要在酒精灯________(填“内”或“外”)焰灭菌,并且待接种环________后沾取菌种,试管口不能离开酒精灯火焰附近。
将接种的试管在适温下培养,长成菌落后放入________℃冰箱中保藏。
答案
(1)氮源 蛋白胨和牛肉膏 灭菌
(2)比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂
(3)高压蒸汽灭菌锅 100 121℃ 15~30min 废弃
(4)适量水 (5)外 冷却 4
解析
(1)培养基中一般都含有水、无机盐、碳源、氮源。
培养基配制完成后要调pH和灭菌。
牛肉膏、蛋白胨中含碳元素,可作为有机碳源。
(2)在配制培养基时营养要协调,按所培养微生物对各种成分的需求确定其成分及比例;
在加入琼脂后,要不断搅拌,防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
(3)培养基的灭菌应用高压蒸汽灭菌锅,在压力为100kPa、温度为121℃条件下,灭菌15~30min。
若棉塞上沾有培养基,易被杂菌污染,应废弃。
(4)高压蒸汽灭菌锅操作步骤为先向锅内倒入水,加热煮沸,将冷空气排出,将锅密闭,继续加热使锅内气压和温度上升到需要的程度。
(5)酒精灯外焰温度高,灭菌效果好。
灼烧后待冷却再沾取菌种,否则会烫死菌种造成实验失败。
15.下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法,请回答相关问题:
(1)图甲是利用________法进行微生物接种,图乙是利用________________法进行微生物接种。
这两种方法所用的接种工具分别是________和________;
对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。
(2)平板划线时,为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少,每次划线都要从__________________开始,平板划线结束后,最后一次划的线不能与第一次划的线________。
(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行?
________________。
(4)下图是接种后培养的效果图解,其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)。
(5)假设用图乙所示方法接种培养结束后,发现培养基上菌落连成一片,可能的原因是什么?
____________________________________________。
答案
(1)平板划线稀释涂布平板接种环涂布器灼烧灭菌
(2)上一次划线的末端相连(或相接、相交、交叉等)
(3)火焰附近存在着无菌区域
(4)图乙
(5)稀释倍数不够,菌液的浓度太高
解析
(1)图甲和图乙分别是平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物接种,这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。
(2)平板划线时,每次划线都要从上一次划线的末端开始,最后一次划线不能与第一次划线相连。
(3)由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域,因此接种常在火焰附近进行。
(4)培养基上的菌落分布均匀,接种方法为稀释涂布平板法。
(5
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