第02章显微镜技术和显微镜在临床检验中的应用知识扩充Word格式文档下载.docx

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后来在显微镜中加入了摄影装置，以感光胶片作为可以记录和存储的接收器。

现代又普遍采用光电元件、电视摄像管和电荷耦合器等作为显微镜的接收器，配以微型电子计算机后构成完整的图像信息采集和处理系统。

目前全世界最主要的显微镜厂家主要有：

奥林巴斯、蔡司、徕卡、尼康。

国内厂家主要有：

江南、麦克奥迪等。

二、主要电镜制备技术介绍

由于电子显微镜本身的分辨能力与性能在不断提高，生物样品制备技术在不断改进，以及电子显微镜技术在细胞生物学研究中所发挥的巨大作用，因此，对电镜观察的生物样品有一些特殊要求：

（1）要求样品很薄。

电子束的穿透能力是十分有限的，即使电场高压增加到100～200kV，电子穿透生物样品的厚度仅达1μm。

故此，用电镜观察样品的精细结构时，首先要求样品很薄，一般是数十纳米。

即使是细菌与其它单细胞生物，假如不经过超薄切片，内部的细微结构也很难观察清楚。

所以，超薄切片（ultrasection）技术是基本的电镜实验技术；

（2）要求更好地保持样品的精细结构。

一般样品制备都要经过一个复杂的过程：

如固定、脱水、包埋、切片、染色等。

所以要使样品尽量保持生活状态下的精细结构而不严重失真，对固定剂与包埋剂的选择以及固定与包埋的条件均要求比较严格

（一）超薄切片技术

由于电子束的穿透能力有限，为获得较高分辨率，切片厚度一般仅为40～50nm，即一个直径为20um的细胞可切成几百片，故称超薄切片。

这需要样品既要有一定刚性又要有一定韧性，而生物样品并不具备这些特性。

为此，样品往往需要包埋在特殊的介质中。

但包埋的过程会破坏样品的结构，所以超薄切片样品制备的第一步就是样品的固定，以更好地保存细胞的精细结构。

1．固定如何保持观察样品的真实性，固定是很重要的一环。

固定不仅要求保持样品的形态结构不发生改变；

有时甚至要求在超微和分子水平上使细胞内部的结构和成分保持在原来的位置上，同时尽量保持原来的性质，如抗原性等。

超薄切片常用的固定剂为锇酸和戊二醛等。

根据需要选择最合适的固定剂。

此外，还可以用物理方法固定，如高频微波。

在固定操作过程中，动物的处死和取材都要快速进行，并通常在低温下固定，以防止酶的自溶作用造成破坏，固定的样品块也不宜太大，以便固定剂迅速渗透。

表3-2几种固定剂对细胞各成分的固定效果

固定剂核酸蛋白质磷脂多糖不饱和脂肪酸

锇酸++++++++++

戊二醛++++++

KMnO4+++++++++++

+表示相对固定效果

2．包埋包埋的目的是要使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好地支撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。

同时要求包埋剂在高倍放大时也不显示其本身结构，还要求在聚合时不发生明显的收缩，以防止样品中细微结构的损坏和移位；

应具有良好的机械性能（如刚度和韧性等）以利于切片；

应易被电子穿透等。

目前常用的包埋剂是环氧树脂。

生物样品固定后通常仍含有大量水分，而包埋剂又多是与水不相溶的，因此在包埋前通常要经过一系列脱水处理过程。

3．切片超薄切片厚度通常是40～50nm。

切片厚度可通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩来控制。

切片刀以玻璃或钻石为材料，最常用的是玻璃刀。

切片须捞在覆有支持膜的载网（铜网或镍网）上才能在电镜下观察。

4．染色样品中的不同成分对各种“染料”有不同的亲和性，如锇酸宜染脂肪；

铅盐易染蛋白质；

醋酸铀易染核酸等。

电镜样品仅用重金属盐进行染色以形成明暗反差，因此只能通过电子束振幅的改变观察到黑白图像。

它不能使光镜切片染色，通过改变波长而获得彩色图像。

几乎各种细胞超微结构都可以用超薄切片法观察。

超薄切片技术显示典型动物细胞的超微结构。

不仅如此，超薄切片技术还可以与放射性同位素自显影、细胞化学、免疫电镜和电镜原位杂交等技术结合，用于不同的研究目的。

（二）负染色技术

某些结构，如线粒体基粒、核糖体和蛋白质及其组成的纤维甚至病毒等可以通过负染色（Negativestaining）电镜技术观察其精细结构。

其分辨率可达1.5nm左右。

负染色是用重金属盐，如磷钨酸或醋酸双氧铀，对铺展在载网上的样品进行染色，吸去多余染料，样品经自然干燥后，整个载网上都铺上了一薄层重金属盐，从而衬托出样品的精细结构。

（三）冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术

用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻（液氮或液氦中），然后在低温下进行断裂。

这时样品往往从其结构相对“脆弱”的部位（即膜脂双分子层的疏水端）断裂。

从而显示出镶嵌在膜脂中的蛋白质颗粒，由于冰在真空中的少量升华，可进一步增强“浮雕”式的蚀刻效果。

用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜，然后用消化液把样品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移到载网上进行电镜观察。

冰冻蚀刻（Freezeetching）技术主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，图形富有立体感，样品不需包埋甚至也不需固定，同时能更好地保持样品的真实结构。

近年来发展起来的快速冷冻深度蚀刻技术（quickfreezedeepetching）就是在此基础上发展起来的。

深度蚀刻主要用于观察胞质中的细胞骨架纤维及其结合蛋白。

（四）电镜三维重构技术

生物大分子的三维结构是当今生命科学研究中的核心课题之一。

电镜三维重构技术是电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术，尤其适于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质－核酸复合物等大的复合体的三维结构。

其基本步骤是对生物样品（如蛋白质二维晶体）在电镜中的不同倾角下进行拍照，得到一系列电镜图片后再经傅立叶变换等处理，从而展现出生物大分子及其复合物三维结构的电子密度图。

最早提出并发展这一技术是英国生物物理学家A.Klug，并因此获得1982年诺贝尔化学奖。

近年来在此基础上发展了低温电镜技术（Cryoelectronmicroscopy），其样品不经固定、染色和干燥，直接包被在约100nm厚的冰膜中，在电镜内﹣1600℃低温下利用相位衬度成像。

该技术不仅更真实地展示出生物大分子及其复合物表面与内部的空间结构，而且还具有更高的分辨率。

电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（StructuralBiology）——主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。

（五）扫描电镜技术

扫描电镜（Scanningelectronmicroscope，简称SEM）是二十世纪60年代才正式问世的。

其电子枪发射出的电子束被磁透镜汇聚成极细的电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，电子束可激发样品表面放出二次电子（同时也有一些其它信号）。

二次电子产生的多少与样品表面的形貌有关。

二次电子由探测器收集，并在那里被闪烁器转变成光信号，再经光电倍增管和放大器又转变成电压信号来控制荧光屏上电子束的强度。

这样，样品不同部位上产生二次电子多或少的差异，直接反映在荧光屏相应部位亮或暗的差别，从而得到一幅放大的立体感很强的图像。

扫描电镜主要是用来观察样品表面的形貌特征，而生物样品在干燥过程中由于表面张力的作用极易发生形变，解决这一问题最常用的是CO2临界点干燥法，即利用CO2在其临界温度以上就不再存在气-液相面，也就不存在引起样品变形的表面张力问题，从而完成生物样品的干燥。

通常用液态CO2等介质浸透样品，然后在临界温度以上使CO2以气态形式逸去。

由于没有气-液相面的形成，也就没有表面张力，样品的形态能得到很好地保持。

此外，为了得到良好的二次电子信号，样品表面需良好的导电性，所以样品在观察前还要喷镀一层金膜。

扫描电镜景深长，成像具有强烈的立体感，可用于观察核孔复合体等更精细的结构。

三、细胞拆合与显微操作技术

真核细胞是由细胞核和细胞质两大部分组成的，为了探明核质相互作用的机理，科学家们创建了细胞拆合技术。

所谓细胞拆合就是把核与质分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。

细胞拆合可以分为物理法和化学法两种类型。

物理法就是用机械方法或短波光把细胞核去掉或失活，然后用微吸管吸取其它细胞的核，注入去核的细胞质中，组成新的杂交细胞。

这种核移植必须用显微操纵仪进行操作。

化学法就是用松胞素B（cytochalasinB）处理细胞，细胞出现排核现象，再结合离心技术，将细胞分拆为核体（karyoplast）和胞质体（cytoplast）两部分。

由于核体外表包有一层细胞膜和少量胞浆，因而在PEG或仙台病毒的介导下，核体可同另一胞质体融合，形成重组细胞。

显微操作技术（micromanipulation）是早期建立的一种胚胎学技术，即在显微镜下，用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射（microinjection）的技术。

现在显微操作装置的设计愈来愈精密，不仅用于核移植，而且亦可对细胞核进行解剖和向核内注入基因。

细胞拆合、显微注射与现代分子生物学技术相结合使这些经典的胚胎学技术展现出极大的潜力，它不仅成为核质关系、细胞内某种mRNA或蛋白质功能等基础研究的重要手段，而且在转基因动物、高等动物的克隆方面的理论与实践研究中取得重大的突破。

四、扫描探针显微镜

SPM（ScanningProbeMicroscope或ScanningProbeMicroscopy）是扫描探针显微镜或扫描探针显微术的缩写，是一个大的种类，目前，SPM家族中已经产生了二三十种显微镜，例如扫描隧道显微镜（ScanningTunnelingMicroscope--STM）、原子力显微镜（AtomicForceMicroscope--AFM）、磁力显微镜（MagneticForceMicroscope--MFM）、静电力显微镜（ElectrostaticForceMicroscope--EFM）等等。

（一）SPM工作原理

扫描探针显微镜（SPM）的工作原理是基于微观或介观范围的各种物理特性，通过原子线度的极细探针在被研究物质的表面上方扫描时检测两者之间的相互作用，以得到被研究物质的表面特性，不同类型的SPM之间的主要区别在于它们的针尖特性及其相应的针尖----样品相互作用方式的不同。

STM的工作原理来源于量子力学中的隧道贯穿原理。

其核心是一个能在样品表面上扫描、并与样品间有一定偏置电压、其直径为原子尺度的针尖。

由于电子隧穿的几率与势垒V（r）的宽度呈现负指数关系，当针尖和样品的距离非常接近时，其间的势垒变得很薄，电子云相互重叠，在针尖和样品之间施加一电压，电子就可以通过隧道效应由针尖转移到样品或从样品转移到针尖，形成隧道电流。

通过记录针尖与样品间的隧道电流的变化就可以得到样品表面形貌的信息。

（二）与其它表面分析技术相比，SPM所具有的独特优点：

（1）具有原子级高分辨率。

STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm，即可分辨出单个原子。

（2）可实时地得到在实空间中表面的三维图像，可用于具有周期性或不具备周期性的表面结构研究，这种可实施观测的性能可用于表面扩散等动态过程的研究。

（3）可以观察单个原子层的局部表面结构，而不是个体像或整个表面的平均性质，因而可直接观察到表面缺陷、表面重构、表面吸附体的形态和位置，以及由吸附体引起的表面重构等。

（4）可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。

这些特点特别适用于研究生物样品和对不同实验条件下对样品表面的评价，例如对于多相催化机理、超导机制、电化学反应过程中电极表面变化的监测等。

（5）配合扫描隧道谱STS（ScanningTunnelingSpectroscopy）可以得到有关表面电子结构的信息，例如表面不同层次的态密度、表面电子阱、表面势垒的变化和能隙结构等。

（三）SPM的应用领域

1．表面结构的确定表面原子结构的确定是表面科学的奠基石。

发明SPM以前，用的是各种衍射方法，诸如低能电子衍射和原子束散射。

然而，这些方法只能提供相对大的面积内平均的原子结构经过傅立叶变换过的信息。

通常，一个表面结构由衍射方法观察以后，不同的作者提出相互抵触的模型，有时也可达到一致的意见，而在多数情况下争论继续存在。

另外，衍射方法只能提供有关相对简单的以及有完整周期性的表面信息。

大而复杂的结构是衍射方法无能为力的。

在实空间中，非周期结构，例如缺陷及局域变异总是存在的。

发明SPM前，没有办法确定这些非周期性结构。

SPM的发明使局面完全改观，到1991年底，借助于SPM，并结合其它的技术，大量表面结构成为已知的。

2．成核过程与晶体生长 

固体表面上的薄膜生长在技术上很重要，而成核现象对生长机理的认识是关键之一。

SPM有能力使局域结构直到原子的细节成像，使它对于成核现象、薄膜生长以及晶体生长的研究成为理想的工具。

3．超导体的局域隧道谱 

Giaever（1960）的经典隧道实验对超导性的BCS理论提供了明确无误的证据，作为局域探针的SPM肯定适于作超导体局域性质的探测，例如Abrikosov磁通晶格。

4．表面化学 

微电子与化学工业的大量工艺过程依赖于固体表面发生的化学反应。

SPM提供一种与众不同的机遇，在原子水平上研究这些化学反应。

例如，观察金属膜与半导体硅化物形成的初始阶段，进而研究Jchottky势垒的形成及晶体取向生长的性质；

通过观察半导体样品表面的能隙状态来研究费米能级的钉扎；

研究表面化学反应的原子级细节；

对原子簇化合物进行深入研究，以寻求更新更多的特种催化剂；

研究吸附质/载体系统，推理吸附分子的局域电子性质和对基底表面结构的影响等。

5．生命科学研究 

SPM技术有在生命科学研究中的应用的诸多优越性，如能够在较高的分辨率水平上观察样品的实三维表面结构；

可在生命的天然条件下或准天然条件下（常温、常压、大气下、潮湿条件下或水溶液条件下），对生物样品的结构进行直接观察，是生命科学家梦寐以求的事情；

视野可从数纳米到一百微米；

样品制作简单，所需样品量极少；

仪器成本低廉等。

由于这些独特的优点，为SPM在生命科学研究中的成功应用展示了广阔的前景。

目前已经取得的成果，无一不显示出SPM在生命科学中应用的生命力。

尽管目前很多成果还是初步的，但已经显示出SPM将有可能在天然和准天然条件下，揭示生命的微观结构，这为揭示活性状态的生命结构及其变化提供了可能。

6．电化学 

电解液与固体表面间的界面处发生的化学过程几个世纪以来一直是科技的丰产田，包括电镀、化学镀、腐蚀与防腐蚀、电池以及其它许多应用。

早就知道电化学过程明显地依赖于电极表面的原子的细节。

例如，对不同结晶学取向上的电镀速率可相差两个数量级。

伏安测量的结果显著地依赖于电极的原子排列，一个无暇的表面通常产生鲜明而可重复的伏安特性。

STM和AFM同样能在液—固界面工作，对电化学过程在原子水平的研究提供自然的工具。

STM对浸没在电解液中固体表面成像的实现为电化学的研究开了一条新路。

在电解液中实现STM的主要困难是隧道电流与感应电流相混，使信噪比变坏。

随着AFM的进展，特别是斥力范畴内的光束偏转法，AFM研究电解液下的固体表面成为现实。

在液—固界面的AFM可常规地达到原子分辨率。

7．表面微细加工 

STM在工作时，探针将充分接近样品产生一高度空间限制的电子束，因此在成像工作时，STM具有极高的空间分辨率。

与一般的聚焦电子束一样，这个高度空间限制的电子束也会在针尖所对应的样品表面微小区域中产生结构性缺陷、相变、化学反应和吸附质移位等干扰，并诱导化学淀积和腐蚀，这正是STM可用于微细加工的客观依据，由于STM装置中针尖与样品的间距很小，为纳米数量级，这样产生的电流总是流至（或发射至）样品表面直径为纳米级大小的区域，由它产生的区域将更小。

因此，用STM进行表面加工一定是在纳米尺度上进行的，即STM所进行的表面加工是纳米加工，以后我们将看到利用STM甚至可对表面单个原子进行操作。

自从STM问世以来，把它作为一种纳米加工工具的研究已经涉及到在表面直接刻写、电子束辅助淀积、微小粒子及单原子操作等方面。

STM在该领域中的实际应用前景是相当诱人的。

首先，通过STM进行的光刻、微区淀积和刻蚀等操作，有可能将目前大规模集成电路线条宽度从微米数量级降到纳米数量级，这是当今世界技术领域追求的目标之一；

当器件尺寸达到纳米级甚至原子级时，量子效应可能起主要作用，这是有可能发现新效应，据此可设计出新器件，用STM等手段实现这些新设想。

其次，利用STM可修补表面掩膜及集成电路等的线路结构。

STM在对表面进行加工处理的过程中，可实时对表面形貌进行成像，这样可发现表面各种结构上的缺陷和损伤，并用表面淀积和刻蚀等方法建立或切断连线，以消除缺陷，达到修补的目的；

而后还可用STM进行成像，以检查修补结果的好坏。

另外，把STM的针尖作为工具，可对原子团或原子在表面上的生长、迁移、扩散等物理过程及微小粒子间的相互作用，微小粒子与表面间的相互作用等进行基础研究，以达到有目的地控制和安排原子团甚至单个原子的目的。

8．表面的直接刻写 

当STM在恒流状态下工作时，突然缩短针尖与样品的间距或在针尖与样品的偏置电压上加一脉冲，针尖下样品表面微区中将会出现纳米级的坑、丘等结构上的变化，这是STM所能产生的最普通的纳米级结构。

产生这些结构时，并不需要在样品表面涂敷抗蚀膜，也不需要特定的液体或气体氛围，可将它们看成是针尖在样品表面上的直接写入。

针尖进行写入操作后一般并未损坏，仍可对表面原子进行成像，以实时检验刻写结果的好坏。

对于不同的刻写操作方式，产生纳米级结构的机理并不一样。

9．电子束光刻 

电子束光刻及电子束辅助淀积和刻蚀是聚焦电子束通常应用的领域。

STM同样可应用在这些领域中，尽管这些应用还很不成熟，但它所进行的工作能获得许多新信息，得到许多新结果。

用聚焦电子束进行光刻时，可在涂敷抗蚀膜的样品表面上直接刻写曝光，以形成各种图形。

通常所用的抗蚀膜有聚甲基丙烯酸甲脂（PMMA）、含有尿烷的聚丁二炔（P4BCMU）等，它们一般只对低能电子（小于20eV）敏感，故对通常所用的透镜聚焦的电子束来说，由于入射电子能量很高（大于5kV），这些抗蚀膜只能通过与一次入射束产生的二次电子的相互作用来曝光，加之存在背散式电子，结果导致抗蚀膜上实际曝光面积总是比一次束束径大许多。

而对于STM，即使工作在场发射模式，也能够提供能量很低的可直接与抗蚀膜发生作用的聚焦电子束。

由于针尖与样品的间距很近，这个低能电子束在样品表面上的有效束径很小，与该间距同一数量级；

另外，STM装置可在水平方向上由计算机控制作精确的扫描，故它非常适用于电子束光刻技术。

在抗蚀膜上进行直接刻写，抗蚀膜的曝光只需通过与一次束的相互作用就可产生，可克服由于与二次电子相互作用所引起的分辨率降低的缺点，能获得更精细的结构，最终提高集成电路的集成度。

另外，用STM进行光刻时，在恒流模式及特定时间间隔内，通过控制偏压（电子能量）就可精确控制曝光电子的能量，根据在不同曝光电子能量下抗蚀膜的变化情况，可对抗蚀膜的曝光机理进行深入研究。

还有，诸如PMMA、P4BCMU等抗蚀膜的曝光时总是有化学反应发生，因而用STM进行光刻时，它一般要工作在场发射模式，以使电子具有足够高的能量来引发化学反应。

这时若忽视几何效应，由于针尖与样品的间距与偏压成正比，故增加偏压，同时将会增加所刻结构的线条宽度。

10．电子束诱导淀积和刻蚀 

电子束诱导淀积和刻蚀是一种在液体或气体氛围下在表面上形成各种结构的方法，它可以看成是气体或液体氛围下的光刻。

这在通常的电子束、离子束、和光束的光刻技术中已被广泛使用。

用STM进行淀积和刻蚀操作的原理非常简单。

在一个非常小的区域内用聚集电子束来提供能量分解化合物，分解产物中可包含金属成分而沉积在表面上，或包含腐蚀成分而参加刻蚀反应，并在表面上进行局域刻蚀。

所用衬底有si、GaAs等半导体及石墨、金属等。

用在液体条件下工作的STM装置，可提供实验要求的液体氛围，此时STM针尖要经过一定的处理，如表面图蜡等以抑制法拉第电流；

也可将STM针尖作为电化学电极而产生局域的法拉第电流，然后用此电流去诱导淀积或腐蚀，此时所得结构的分辨率比直接用隧道（或场发射）电流时要低，目前，还达不到纳米级水平。

气体氛围通常是通过在真空室中引入金属有机化合物气体来实现的。

真空室本底压强为10-5--10-6Pa，引入气体一般到几帕数量级，所用气体有二甲基镉（DMCd）、W（CO）6、WF6及Au的有机化合物等，随所需淀积金属的不同而各异。

有三种可能的机理可以解释这些有机化合物分子的分解原因，其一是针尖与样品间的非弹性隧道电子直接打碎吸附在衬底表面上的分子；

其二是高电流密度使针尖下表面微区升温引起吸附分子解热；

其三使针尖与样品间的高电场发射电子使气体分子解离建立微区等离子体，并在表面上淀积分解析出的金属原子。

无论哪种机理，均需使化学键断裂，这些能量来自针尖与样品间的电子，此时STM主要工作在场发射模式。

11．单原子操作 

STM不仅可以在各种样品表面上进行直接刻写、光刻以及诱导淀积和刻蚀等，它还可以把吸附在表面上的吸附质，如金属小颗粒、原子团及单个原子等从表面某处移到另一处，即对这些小粒子进行操作。

STM在这些方面的应用为用不同材料的微小粒子来构造器件的研究提供了有用的工具，它还可用来研究粒子与粒子之间粒子与衬底间的相互作用。

用STM甚至有可能用一个个原子构造分子或者把分子分解成一个个原子。

表面上最简单的吸附质是单个原子，运用STM可以按照人们的意愿有目的地移动这些单个原子。

STM装置中针尖与样品间总是存在着一定的作用力，它由范德华力和静电力两部分组成。

调节针尖的位置和偏压就有可能改变这个作用力的大小和方向，而沿着表面移动单个原子所需力比使该原子离开表面所需力小，这样可以通过调节针尖的位置和偏压就有可能运用它来移动吸附在表面上的原子，而不使它们从表面上脱离。

移动操作的最终结果必然可以使在表面上吸附的原