科研指标测定方法.docx
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科研指标测定方法.docx
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科研指标测定方法
指标:
1、品质指标
硬度、色泽、褐变指数、失重率、腐烂率、可溶性固型物、呼吸强度、乙烯释放率、可滴定酸、Vc
2、抗性指标
抗氧化衰老的有:
SODCATAPXGSHMDA原果胶(可溶性果胶)
抗病相关指标有:
PPOPODCHTGULPAL总酚类黄酮木质素
3、测定方法:
褐变指数
色泽
失重率
腐烂率
呼吸强度
乙烯释放率
硬度
可溶性固型物
可滴定酸:
试剂:
0.1mol/LNaOH(4g纯+1000ml蒸馏水,邻苯二甲酸氢钾标定)1%酚酞试剂(1g酚酞加入到100ml50%的乙醇溶液中溶解)
方法:
1、NaOH的标定:
准确称取105℃下烘干至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾0.6g,加入50ml新煮沸过的冷水,振摇,使其尽量溶解,再滴加2滴1%酚酞指示剂,用配置的NaOH溶液标定,滴定至溶液呈粉红色。
每1mlNaOH相当于20.42mg邻苯二甲酸氢钾,计算出NaOH滴定液的浓度。
2、测定步骤:
称10g苹果,研磨,转移到100ml容量瓶中,蒸馏水洗研钵3次再定容,摇匀,静置30min后过滤。
吸取20ml滤液,转入三角瓶中,加入两滴1%酚酞试剂,用已标定的氢氧化钠溶液进行标定,滴定至溶液初现粉色并30秒内不退色为终点(PH8.1-8.3),重复三次,再用蒸馏水作为滤液进行滴定作为空白对照。
可定丁酸含量=【样品提取液总体积*氢氧化钠滴定液浓度*(滴定滤液消耗的氢氧化钠体积—滴定蒸馏水消耗的氢氧化钠体积)】/(滴定时所取滤液体积*样品质量)
Vc:
试剂:
5%钼酸铵溶液(称取5g钼酸铵溶于蒸馏水中,并定容至100ml)草酸-EDTA溶液(称取6.3g草酸和0.75gEDTA-Na2溶于蒸馏水中并定容至1000ml)5%H2SO4(体积分数)偏磷酸-乙酸溶液(取棒状偏磷酸3g加20%冰醋酸48ml,溶解后加蒸馏水稀释至100ml,必要时过滤,在冰箱中可保存3天)Vc标准溶液(称取Vc100mg,置100ml容量瓶中,加适量草酸-EDTA溶液溶解后,在用该溶液定容到100ml,即成1mg/ml标准液,此溶液随配随用)(如果纯度不够应进行标定)提取及测定:
1、制作标准曲线:
7支25ml具塞试管,按下表加入各种试剂
试管号试剂1234567
/ml00.10.20.40.60.81.0Vc标准液/ml5.04.94.84.64.44.24.0EDTA溶液草酸/ml0.50.50.50.50.50.50.5-乙酸溶液偏磷酸1:
19H2SO4/ml1.01.01.01.01.01.01.0
/ml2.02.02.02.02.02.02.05%钼酸铵/mg01020406080100Vc含量加完试剂摇匀后,置30℃水浴中保温15min,用蒸馏水稀释至25ml,混匀,用1号空白管调零,在760nm波长下比色,记录吸光度,以Vc含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
2、提取及测定:
称取5g果蔬组织,加5ml草酸-EDTA溶液研磨成匀浆,并仔细转入25ml容量瓶中,再用提取介质冲洗研钵,冲洗液一并倒入容量瓶中。
取一部分匀浆液经3000g离心10min后,取1ml上清液与标准管同法测定,若样品显色液中出现沉淀,可过滤后进行比色,不影响测定结果。
计算公式:
Vc含量(mg*100g-1FW)=标准曲线上查的的Vc的量*样品提取液总体积/(测定时所用样品液体积*样品鲜重)注意:
显色温度和加入显色剂后的时间要一致。
GSH:
试剂:
50g/L三氯乙酸(5g三氯乙酸和蒸馏水溶解稀释至100ml,再加入186mgEDTA-Na2.2H2O)0.1mol/LPH7.7磷酸钠缓冲液和0.1mol/LPH6.8磷酸钠缓冲液4mmol/L二硫代硝基苯甲酸(15.8mgDTNB,用0.1mol/L、PH6.8磷酸缓冲液溶解,定容至10ml,摇匀,4℃保存)100umol/L还原性谷胱甘肽标准液(3g还原型谷胱甘肽加入少量无水乙醇用蒸馏水定容至100ml)
实验步骤:
1、标准曲线制作:
取六只试管编号,按下表加入各种试剂,混匀,于25℃保温反应10min,以0号管为参比调零,测定显色液在波长412nm处的吸光度值,以吸光度值为纵坐标,还原型谷胱甘肽为横坐标,绘制标准曲线。
管号项目
012345
/ml00.20.40.60.81.0还原型谷胱甘肽标液/ml1.00.80.60.40.20蒸馏水/ml1.01.01.01.01.01.0磷酸缓冲液PH7.7/ml0.50.50.50.50.50.5试剂DTNB/umol020406080100相当于还原型谷胱甘肽物质的量2、提取和测定:
5g果实加入经预冷的三氯乙酸,在冰浴下研磨匀浆,于4℃、12000xg离心20min,收集上清液测定。
取一只试管,依次加入1ml蒸馏水、1mlPH7.7磷酸缓冲液和0.5mlDTNB,混匀即为绘制标准曲线的0号管溶液,此液作为参比调零。
另取两支试管,分别加入1ml上清液、1mlPH7.7磷酸缓冲液,然后向一只管中加入0.5mlDTNB,向另一支管中加入0.5mlPH6.8磷酸缓冲液。
将两只管置于25℃下保温反应10min,迅速测定显色液在波长412nm下的吸光度值,分别记作ODs和ODc。
重复三次。
根据ODs-ODc的差值从标准曲线上查的还原型谷胱甘肽含量,计算每克果实中还原型谷胱甘肽的含量:
还原型谷胱甘肽含量=(标准曲线上查得的值*样品提取液总体积)/(吸取样品液体积*样品质量)注意:
先做样品本底对照。
.
MDA:
试剂:
100g/L三氯乙酸(称取10g三氯乙酸蒸馏水溶解稀释至100ml)6.7g/L硫代巴比妥酸(称取0.67g硫代巴比妥酸,用100ml0.05mol/L氢氧化钠溶解)
测定步骤:
称取1g果蔬样品,加入5ml三氯乙酸溶液,研磨匀浆于4℃10000g离心20min,收集上清液低温保存备用。
取2ml上清液,对照空白管中加入2ml三氯乙酸代替提取液,分别加入2ml0.67%硫代巴比妥酸,混合后在沸水浴中煮沸20min,取出冷却后再离心一次,分别测定上清液在450nm、532nm、600nm波长处的吸光度值,重复三次。
计算:
丙二醛含量(umol/L)=6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450
每克果蔬中丙二醛的含量=丙二醛含量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量*1000)注意:
出现负值,表明糖的影响很大,需做预实验确定适宜的
条件。
原果胶(可溶性果胶):
试剂:
1.5g/L咔唑-乙醇溶液(称取0.15g咔唑加入无水乙醇溶解并稀释至100ml)
100ug/ml半乳糖醛酸标准液(称取10mg半乳糖醛酸,用蒸馏水溶解定容至M=194100ml)浓硫酸95%乙醇0.5mol/L硫酸溶液
测定步骤:
1、制作标准曲线:
取6支25ml具塞刻度试管,编号,按下表加入半乳糖醛酸标准液,然后小心地沿管壁加入6ml浓硫酸,在沸水浴中加热20min,取出冷却至室温后,各加入0.2ml1.5g/L咔唑-乙醇溶液,摇匀,在暗处放置30min后,测定反应液在波长530nm处的吸光度值,并以吸光度值为纵坐标,半乳糖醛酸质量(ug)为横坐标,绘制标准曲线求出方程。
管号项目
012345
/ml00.20.40.60.81.0半乳糖醛酸标准液/ml1.00.80.60.40.20蒸馏水/ug020406080100相当于半乳糖醛酸的量2、提取测定:
(1)可溶性果胶提取:
称取1g果蔬组织,研磨成匀浆转入50ml刻度离心管中,加入25ml95%乙醇,在沸水浴上加热30min,以除去样品中糖分及其他物质,注意在煮沸过程中要及时补加95%乙醇。
取出冷却至室温,于8000r/min离心5min,弃去上清液,再加入95%乙醇在沸水浴上加热,如此重复3-5次。
然后将沉淀放入试管中,加入20ml蒸馏水,在50℃水浴中保温30min,以溶解果胶。
取出冷却至室温后,于8000r/min下离心15min,将上清液移入100ml容量瓶中,用少量水洗涤沉淀,离心后一并将上清液移入容量瓶中,加蒸馏水至刻度,此溶液即为可溶性果胶。
(2)原果胶提取:
将上述遗留的沉淀物,保留在刻度离心管仲,再向其中加入25ml0.5mol/L硫酸溶液,在沸水浴中加热1h以水解原果胶,取出冷却至室温后,于8000r/min下离心15min,将上清液移入100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,此为原果胶测定液。
(3)测定:
吸取1ml提取液,加入到25ml刻度试管中,按标准曲线的操作步骤进行测定,重复三次。
计算:
根据吸光度值查得半乳糖醛酸质量,计算每克果蔬中果胶含量,以半乳糖醛酸质量分数表示。
.
半乳糖醛酸含量=查得的半乳糖醛酸量*样品提取液总体积/(测定时所取样品液体积*样品质量)注意:
检验糖分是否除尽的方法:
取0.5ml提取液置于试管中,加入2-3滴50g/Lα-萘酚的乙醇溶液,充分混合,此时溶液稍有白色沉淀,然后使试管稍稍倾斜,用吸管沿管壁加入1ml浓硫酸(注意水层与硫酸层不可混合)。
待试管静置后,若在两层的界面上产生紫红色环,则证明提取液中含有糖分
总酚:
试剂:
钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、硫酸锂(Li2SO4)、磷酸(H3PO4≥85%)、磷钼酸(24MoO3·P2O5·xH2O)、碳酸钠(Na2CO3)、盐酸和溴水为分析纯。
一水合没食子酸标样为Sigma-Aldrich公司产品。
水为蒸馏水。
1.1.2FC显色剂:
称取50.0g钨酸钠和12.5g钼酸钠,用350mL蒸馏水溶于1
000mL回流瓶中,加入25mL磷酸和50mL盐酸,混匀,微沸回流2h,加入75.0g硫酸锂、25mL蒸馏水和数滴溴水,开口沸腾约15min(至溴水挥尽为止),冷却,定容至500mL,过滤,置棕色瓶中保存备用。
使用时加入1倍蒸馏水稀释。
1.1.3FD显色剂:
称取100.0g钨酸钠和20.0g磷钼酸,溶于200mL蒸馏水,
加入50mL磷酸,加热回流2h,冷却,定容至1L。
1.1.47.5%碳酸钠溶液:
称取37.5g碳酸钠,溶于250mL温水,混匀,冷却,
定容至500mL。
1.1.5一水合没食子酸标准溶液:
称取0.110g一水合没食子酸,用蒸馏水溶解、定容至100mL,此溶液质量浓度为1000mg/L。
分别吸取此溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL至100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,所得一水合没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0.0、10、20、30、40、50mg/L。
取试样适量(葡萄酒吸取2mL,葡萄和柿子称取2g匀浆,其他水果称取5g匀浆),用80mL蒸馏水洗入100mL容量瓶中,至100℃沸水浴中保温30min,取出,冷却,定容,过滤,滤液备用。
使用5mL刻度吸管吸取1.0mL滤液(若多酚含量过高,可适当稀释)或一水合没食子酸标准溶液,分别用刻度吸管加入FC显色剂或FD显色剂及7.5%碳酸钠溶液,用蒸馏水定容至10mL,混匀,室温显色(下同),测定765nm吸光度,根据稀释倍数和从标准曲线中查出的浓度,
计算样品多酚含量。
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