《环境催化与材料》课程设计《绿色化学的生物催化》Word文档格式.docx
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绿色化学能产生更大的环境优势。
在降低生产消耗的同时也提高化学过程的效率。
其中一条重要的途径就是了解自然界是如何合成各种化学物质的。
即研究生物体如何通过基因编码的各种酶催化合成各种物质,在这种生物催化过程中酶是有效的合成工具,既可以合成各种分子。
包括氧气、氨气、甲烷等简单的分子和葡萄糖等碳水化合物,也可合成青霉素等抗生素、青蒿素等抗疟疾药物、紫杉醇等抗癌症药物,还可合成生物质(能再生的有机物质,包括农产品及农业废料、木材及木材废料、动物废料、城镇垃圾及水生植物)的主要成分——纤维素、木质素。
随着大规模基因测序技术、生物信息学和高通量筛选技术的发展.目前分析基因序列和发现新酶的速度是十几年前无法想象的。
宏基因组学和序列挖掘的方法大大缩短了新酶发现的周期。
利用宏基因组学的方法,可从不可培养的微生物样品中直接抽提DNA,然后进行克隆表达和功能筛选,它克服了许多特殊微生物不可人工培养的障碍,大大提高了发现新酶的可能性。
由于公布的基因库数据迅速增长,序列挖掘的方法变得越来越吸引人,即通过比对已知酶的序列来发现具有类似序列的新酶。
随着功能基因组研究的深入,已能够找到催化剂的功能基因,它所表达的酶催化剂能在完全“绿色”的溶剂(水)中表现出高度的区域选择性(即对底物分子不同位置的相同基团具有识别作用)、立体选择性(即对底物分子的不同立体异构体具有辨别功能),并且反应条件温和、高效节能。
生物催化(Biocatalysis)是指用酶或有机体(细胞、细胞器等)作为催化剂实现化学转化的过程,又称生物转化(Biotransformation)。
工业生物催化是生物技术的第三次浪潮,也是实现绿色化学的重要途径。
绿色化学要求采用无毒无害的原料,在无毒害的反应条件下进行,具有“原子经济性”,即反应具有高选择性,极少副产品。
甚至“零排放”;
产品对环境友好.进入21世纪后,面对化石资源不断枯竭、环境污染日益加剧的严重局面,人类面临着前所未有的生存与发展的危机.因此传统的物质加工业必须进行革命性转变,转向以生物可再生资源为原料、环境友好的、过程高效的生物加工业。
其核心技术为生物催化.因此人类社会的可持续发展迫切需要生物催化技术。
随着对酶不断深入的认识和社会发展的实际需求,酶的应用范围已遍及食品工业、农业、医药卫生行业、环保、能源开发和生命科学等各个方面,其中,生物催化在制药、化工等制造行业中的应用越来越被重视,并已取得空前的发展,生物制造成为生物技术六大产业之一。
2生物催化在绿色化学中的的应用
生物催化正成为一种重要的药物分子绿色合成技术。
该技术满足绿色化学的12个原则,对绿色化学的发展日趋重要旧m1。
具体而言,生物催化可通过催化高立体和高区域选择性反应来防止废物的产生,利用水作为反应溶剂来防止或减少有害有机溶剂的应用,根据催化反应在常温常压进行的特性来设计高能效和安全的化学合成工艺,充分利用可降解的可再生原料以提高原子经济效益。
本节列举一些新近的生物转化例子,说明生物催化在建立环境友好和经济有效的绿色化学过程中的应用前景。
多数酶催化反应在温和条件下进行,区域和立体选择性高,这和化学催化或利用手性试剂来进行化学计量(stoichiometricamount)的化学拆分很不相同。
例如在Lylica的活性成分pregabalin的第一代生产路线中(图式1),cyanodiester(CNDE)水解脱羧和加氢后得到消旋卢.氨基酸,最后进行化学拆分。
为了得到高光学纯度(99.5%)的活性药物成分(API),(s).扁桃酸拆分后需要进一步重结晶,但两步反应得率只有25%-29%。
由于不需要的对映体回收比较困难,整个过程的产率只有18%一21%。
这样,拆分步骤之前70%的原材料(包括中间体、试剂和溶剂)最后都成为废物。
图式1利用化学拆分合成pregabalin
在利用生物转化的第二代生产路线中(图式2),酶拆分在第一步进行,不需要的对映体可以很容易回收‘铲剐。
相比之下,利用化学方法对二酯进行区域和立体选择性水解仍有挑战性。
另外,图式2的3步反应都在水中进行。
因此,该新工艺不仅免除了传统的(S)一扁桃酸化学拆分过程和图式1所示的大部分有机溶剂,不需要对映体的回收,同时还可以使收率和通量(throughput)加倍提高。
图式2Pregabalin的绿色化学酶法合成路线‘
生物催化也可用于建立以天然产物为基础的药物绿色化学合成路线。
这些药物往往结构复杂,不稳定,而且带高密度的官能团,其化学合成通常需要各种保护和去保护步骤。
生物转化反应条件温和,选择性高,利用酶催化进行合成往往很有利。
一个例子是青霉素酰化酶在卢一内酰胺类抗生素生产中的应用。
口一内酰胺类抗生素主要由6一氨基青霉烷酸(6-APA)或者氨基去乙酰氧基头孢霉烷酸(7-ADCA)衍生合成。
目前世界上6一APA和7-ADCA的年产量分别是8000吨和600吨。
但直到最近,这两种中间体一直由青霉素G通过化学脱酰基法制备。
在该工艺中,青霉素G的羧基首先需硅烷化以进行保护,随后进行选择性脱羧,最后除去保护基团(图式3,以6-APA为例说明,R=H或0H)。
该方法需要化学计量的硅烷化试剂,氯化磷,Ⅳ,Ⅳ.二甲基苯胺和大量的二氯甲烷;
而且,反应在-40℃中进行。
图式3半合成β-内酰胺类抗生紊的化学法合成‘
相比之下,青霉素G酰化酶催化的脱酰基反应在室温水溶液中进行,无须引入保护和去保护步骤。
而且,通过反应工程的研究和酶固定化,青霉素G酰化酶催化6-APA与氨基酯或氨基酰胺进行酰化反应可合成众多的半合成β-内酰胺类抗生素,如青霉素,阿莫西林,头孢克洛,头孢氨苄和头孢羟氨等(图式8)mo。
类似的方法也可应用于7-ADcA及其衍生抗生素的合成。
图式4半合成β-内酰胺类抗生素的酶法合成‘
通过生物催化,廉价的可再生资源可用于合成光学纯化合物。
利用这一点,人们可以按照绿色化学原则来设计药物合成路线。
光学纯化合物通常比较难于用常规方式合成,或者合成来源受到限制。
近年来天然产物的生物合成和代谢工程领域的进展已使适合工业应用的新型高效生物催化剂成为可能,一个突出例子是莽草酸的生产。
莽草酸是预防和治疗感冒病毒感染的药物唾液酸苷酶抑制剂磷酸奥司米韦合成的关键起始原料(图式4)。
随着人们对禽流感病毒爆发的恐惧日增,世界上很多国家都在建立Tamiflu库存,以此作为全国性感冒流行预防计划的一部分。
在R0che公司的磷酸奥司米韦10步合成路线中,莽草酸是关键中间体.因为其3个手性中心和环状骨架在形成最后的API结构时非常重要。
在实际生产中,莽草酸从八角茴香中分离,或者由大肠杆菌工程菌发酵获得(图式5)。
莽草酸是芳香族氨基酸生物合成的一种共同前体,其微生物合成在两种莽草酸盐激酶同工酶都缺失的大肠杆菌工程菌中进行。
目前已发现多种代谢工程策略可提高由葡萄糖合成莽草酸的效价和收率∞],最终获得的大肠杆菌菌株合成莽草酸的效价为84g/L,收率为原料葡萄糖的33%。
随着对Tamiflu。
需求的迅速增长,由资源丰富的玉米淀粉获得廉价的葡萄糖并进一步通过生物催化合成莽草酸已成为Tamiflu合成所需莽草酸的主要来源。
图式5由莽草酸合成磷酸奥司米韦的传统路线
目前磷酸奥司米韦合成路线的一个缺点是API终产物中氨基部分来自易爆的叠氮化物。
这促使人们去寻找一条无叠氮化物参与的替代途径。
最近报道了一个新的合成途径,无叠氮化物参与,而且比常规商业合成途径步骤要少(图式6)。
该途径首先通过两个微生物转化过程把葡萄糖转化为氨基莽草酸,然后再以氨基莽草酸为起始物合成磷酸奥司米韦。
其中,21143把葡萄糖转化为kanosamine;
能表达Amy如合成酶基因的莽草酸衍生物产生菌株,进一步转化为氨基莽草酸。
在这两个微生物转化过程中,由葡萄糖生成氨基莽草酸的总产量为5%m3;
由氨基莽草酸生成磷酸奥司米韦的收率则为22%。
如果生物催化步骤的效率能进一步提高,这一合成途径会有巨大的潜力。
图式6以氨基莽草酸为中间产物的磷酸奥司米韦的新合成路线
植物次生代谢产物构成了药物研制的一个丰富的天然产物可再生资源。
但是,从植物获得一个稳定的活性物质来源往往比较困难。
一个突出例子是紫杉醇。
紫杉醇是一种双萜类生物碱,最初从一种太平洋紫杉短叶红豆杉的树皮中提取,其提取得率仅仅为0.014%。
而且,紫杉醇的提取需要剥取树皮,这往往使需要大约两百年才能长成的红豆杉不能继续存活。
基于此,可建立一种从含量更为丰富的紫杉烷10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ出发的半合成方法(图式7)。
图式7由10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ合成紫杉醇‘
但是,这个半合成工艺比较复杂,需要11个化学转化和7个分离步骤。
因此,有研究者另外建立了一个通过紫杉细胞的培养来制备紫杉醇并进一步通过层析和重结晶进行纯化的工艺。
紫杉醇的生物合成由异戊烯焦磷酸和法呢基焦磷酸两种类异戊烯前体开始(图式8)。
图式8由焦磷酸盐合成紫杉醇‘
总之,生物催化是符合绿色化学原则的新技术。
正如普瑞巴林、奥司米韦和聚酮类抗生素等物质的合成所显示的,生物转化非常适合于在室温水溶液中催化高区域和高立体选择性的反应,而这种反应传统化学方法是难于进行的。
3生物催化在药物合成中的应用
将生物催化整合人药物合成过程时,逆合成分析特别重要。
例如,ruprintrivir是鼻病毒的一种抑制剂,其第一代合成路线很长而且收率较低。
但是,该抑制剂的ketomethylenepeptidoIIlimetic部位上一个键不寻常断裂的发现使得从Pl,P2,P3和P44个单元合成这种复杂的化合物成为可能(图式9)。
图式9由P2合成ruprintrivir
蛋白质工程是对酶功能进行微调的一个非常有用的工具,但该方法耗时长,费用很高。
很多情况下,底物修饰和介质优化是一种更经济快捷的手段,而且可以有效地运用到已有的化学合成工艺中。
除了工艺设计、底物修饰、介质优化和其他反应工程方法可以用在工业规模建立药物合成的化学酶法工艺外,新酶发现和定向进化也可以作为备选的整合方法。
随着基因数据库和蛋白质数据库的迅速扩大,借助生物信息学方法,在短时间内可获得一个酶库。
随后,可对最佳的生物催化剂(但还不是最优化的)进行改造。
如腈水解酶催化的pregabalin合成工艺的建立(图式10),
图10利用腈水解酶合成pregaba1in‘7’
利用定向进化的另一个例子是用于(R)-4.cyano-3-hydroxybutylicacid(阿托伐他汀合成路线的关键中间产物)合成的腈水解酶的改造(图式11)。
初步筛选获得的腈水解酶可在24h内把3-羟基戊二腈(HGN)完全转化为(R)-4-氰基.3-羟基丁酸,底物浓度为3mol/L时产ee值为88%。
图11腈水解酶定向改造后用于阿托伐他汀合成
新酶也可以通过宏基因组学方法从环境样品中获得。
在他汀(statin)类HMG-CoA还原酶抑制剂的乳醇前体合成中(图式12),来自大肠杆菌的5-磷酸脱氧核糖醛缩酶(DERA)以一锅串联方式催化2分子乙醛和1分子氯乙醛缩合。
图式12DERA催化醛醇缩合反应用于他汀类药物合成
总之,为找到经济和环境友好的药物合成途径,生物催化需要和现代化学合成技术在逆合成水平上进行整合。
生物转化的成功实施需要底物修饰、介质优化、工艺设计、酶学和基于生物信息学的新酶发现和定向进化等策略的综合运用。
4生物催化在天然产物修饰中的应用
自然界在长期进化中形成的酶能催化合成从简单气体分子到复杂天然产物在内的各种分子,但其中的很多酶仍没能为合成化学家所利用。
过去10多年是一个天然产物和次生代谢产物合成代谢途径及其酶催化机制的知识爆炸性增长的时期。
4.1卤化反应
天然产物往往需要氯在合适位置才能有生物活性。
对于富电子底物,自然界一般利用黄素依赖型的卤化酶或卤素过氧化物酶来催化氯化、溴化或碘化作用。
对于烷烃等缺电子底物,则往往利用单核铁卤化酶。
另一方面,氟化作用采用了一种SN2亲核取代机制。
。
尽管酶催化卤化反应的应用还处于早期,但已经显示出很大的应用潜力。
例如色氨酸7.卤化酶等FADH2卤化酶可以催化一系列的吲哚衍生物和芳香杂环化合物的区域特异性卤化反应。
同样是利用色氨酸7-卤化酶,在体内组合进行卤化和糖化反应的基础上,构建了一个可用于抗癌的蝴蝶霉素类化合物库(图式13),
图式13卤化酶用于蝴蝶霉素类化合物的合成
4.2大环化作用
多数情况下,线性的NRP和PK框架结构在进一步的后合成酶修饰前,先进行环化作用以形成大环内酯或巨内酰胺。
大环结构通常是天然产物具有生物活性所必须的。
环化酶具有丰富的底物多样性,不仅可以催化线性硫酯底物高效合成18-42元环的巨内酰胺,而且底物除两个基团外,其他所有基团均可被取代。
在另一个研究中,4个相邻的氨基酸被聚酮化合物替代后,环化酶催化形成了杂合的肽聚酮化合物环状分子(图式14),
图式14环化酶可催化合成新型的PP/PKs
4.3糖基化作用
近来多种糖基转移酶的发现极大地促进了糖基化的分子的合成。
该方法与化学方法互补,或者比后者效果更好。
例如,一种来自糖肽A-40926合成酶的Gtf可接受多种糖底物,从而形成新的糖肽(图式15),
图式15利用酶促糖基化和酰化作用合成新型糖肽
5结语
在漫长的进化中,自然界形成了各种各样的酶来合成各种各样的天然产物和代谢产物。
近年来生物合成研究的进展显示,其中很多都可用于化学酶法合成的转化反应。
例如,借助于对酶催化杂环化反应的理解,人们发现了新型的天然产物类似物。
为进一步把这些催化剂作为化学合成工具,学科间的交叉结合非常重要。
新型生物催化剂的发现及其在工业合成中的成功应用需要类似物合成、底物修饰、酶学、蛋白质表达和纯化、工艺设计、代谢工程和酶定向进化等技术的综合运用。
基于这些领域近年来的研究进展,酶在化学合成工业,绿色化学和药物合成中的应用前景十分看好。
参考文献
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