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菌体抗原,鞭毛抗原,表面抗原,菌毛抗原

2．主要的抗原抗体反应有:

凝集反应,沉淀反应和免疫反应

三.选择

1．下述细胞中能够产生抗体的是：

（b）

at细胞bb细胞cnk细胞d巨噬细胞

2.下述细胞中不属于特异性免疫细胞是：

（c）

at细胞bb细胞cnk细胞d抗原提呈细胞

四.问答

1．细菌的抗原种类有那些。

i.表面抗原,如荚膜抗原;

ii.菌体抗原,如o抗原;

iii.鞭毛抗原,如h抗原;

iv.菌毛抗原,

v.外毒素抗原和内毒素抗原

第二篇：

微生物学实验

细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。

测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法（directmicroscopiccount）、平板菌落计数法（platecount）、光电比油法（turbidityestimationbyspectrophotometer）、最大或然数法（mostprobablenumbermpn）以及膜过滤法（membranefiltration）等。

测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、rna和dna的含量测定，代谢产物的测定等。

总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。

本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一显微镜直接计数法

（一）目的要求

1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

目前国内外常用的计菌器有：

血细胞计数板、peteroff-hauser计菌器以及hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。

后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。

显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。

但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。

目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。

本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。

另外两种计菌器的使用方法可参看各厂商的说明书。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。

该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；

中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。

血细胞计数板构造如图l5-1。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格（图15—2）；

另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。

每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3（万分之一毫升）。

图15—1血细胞计数板构造

（一）图15—2血细胞计数板构造

（二）

a.正面图；

b.纵切面图；

放大后的方格网，中间大方格为计数室

1.血细胞计数板；

2.盖玻片；

3.计数室

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成lml菌液中的总菌数。

设五个中方格中的总菌数为a，菌液稀释倍数为b，如果是25个中方格的计数板，则

1ml菌液中的总菌数=a/5×

25×

104×

b=50000a·

b（个）

同理，如果是16个中方格的计数板，

16×

b=3201Xa·

（三）器材

1．菌种酿酒酵母

2．仪器或其他用具血细胞计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细滴管。

（四）操作步骤

l．菌悬液制备

以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。

2．镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。

若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

3．加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。

取样时先要摇匀菌液；

加样时计数室不可有气泡产生。

4．显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。

调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。

每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。

位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。

如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。

计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

5．清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。

镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。

若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。

（五）实验报告

l．结果

将结果记录于下表中。

a表示五个中方格中的总菌数；

b表示菌液稀释倍数。

各中格中菌数ab二室平均值菌数/ml

12345

第一室

第二室

2．思考题

（1）根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面?

应如何尽量减少误差．力求准确?

（2）某单位要求知道一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1～2种可行的检测方法。

二平板菌落计数法

学习平板菌落计数的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。

但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可来自样品中的2～3或更多个细胞。

因此平板菌落计数的结果往往偏低。

为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（colony-formingunits，cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。

1．菌种大肠杆菌菌悬液。

2．培养基牛肉膏蛋白陈培养基。

3．仪器或其他用具lm1无菌吸管，无菌平皿，盛有4.5ml无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。

l．编号

取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6。

（稀释度）各3套。

另取6支盛有4.5ml无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

2．稀释

用lml无菌吸管吸取lml已充分混匀的大肠杆菌菌县液（待测样品），精确地放0.5ml至10-1的试管中，此即为10倍稀释。

将多余的菌液放回原菌液中。

optionsemailreplies将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。

另取一支lml吸管插入10?

1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。

吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸人管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。

用此吸管吸取10-1菌液lml，精确地放0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。

……其余依次类推，整个过程如图15-3所示。

放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。

3，取样

用三支1ml无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6。

的稀释菌悬液各lml，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。

不要用lml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀释菌液放入平皿臼，这样容易加大同一稀释度几个重复平板间的操作误差。

图15—3平板菌落计数操作步骤

4．倒平板．

尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基约15毫升/平皿，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。

由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并于已冷却至45℃左右的培养基，立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。

待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养。

5．计数

培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的平均菌落数×

稀释倍数×

5

一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适。

同一稀释度的三个重复对照的菌落数不应相差很大，否则表示试验不精确。

实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。

由10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。

平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。

一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。

平板菌落计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可以用涂布平板的方式进行。

二者操作基本相同，所不同的是后者先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并于37℃左右的温箱中烘烤30min，或在超静工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取稀释好的菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20～30min，使菌液渗入培养基表层内，然后倒置37℃的恒温箱中培养24～48h。

涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。

五、实验报告

1．结果

2．将培养后菌落计数结果填入下表

稀释度10-410-510-6

cfu数/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

（1）为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板?

（2）要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键?

为什么?

（3）试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点及应用。

（4）当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在一起时，你认为问题出在哪里?

（5）用倒平板法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不同?

为什么要培养较长时间（48h）后观察结果?

三光电比浊计数法

一、目的要求

1．了解光电比浊计数法的原理。

2．学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。

二、基本原理

当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。

在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出（图15-4）。

因此，可用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—菌数标准曲线。

然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。

制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。

本实验采用血细胞计数板计数。

光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。

但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响。

因此，对于不同微生物的菌悬液进行光电比浊计数应采用相同的菌株和培养条件制作标准曲线。

光波的选择通常在400~700nm之间，具体到某种微生物采用多少还需要经过最大吸收波长以及稳定性试验来确定。

另外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。

图15—4比浊法测定细胞浓度的原理

1．菌种酿酒酵母培养液

2．仪器或其他用具721型分光光度计，血细胞计数板，显微镜，试管，吸水纸，无菌吸管，无菌生理盐水等。

1．标准曲线制作

（1）编号取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为1、2、3、4、5、6、7。

（2）调整菌液浓度用血细胞计数板计数培养24小时的酿酒酵母菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×

106、2×

106、4×

106、6×

106、8×

106、10×

106、12×

106含菌数的细胞悬液。

再分别装入已编好号的1至7号无菌试管中。

（3）测od值将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定od值。

比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并将od值填入下表

管号12345678

细胞数106/ml

光密度（od）

每管菌悬液在测定od值时均必须先摇匀后再倒入比色皿中测定

（4）以光密度（od）值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品测定

将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇均匀后，用560nm波长、lcm比色皿测定光密度。

测定时用无菌生理盐水作空白对照。

各种操作条件必须与制作标准曲线时的相同，否则，测得值所换算的含菌数就不准确。

3．根据所测得的光密度值，从标准曲线查得每毫升的含菌数。

每毫升样品原液菌数=从标准曲线查得每毫升的菌数×

稀释倍数

（1）光电比浊计数的原理是什么?

这种计数法有何优缺点?

（2）光电比浊计数在生产实践中有何应用价值?

（3）本实验为什么采用560nm波长测定酵母菌悬液的光密度?

如果你在实验中需要测定大肠杆菌生长的od值，你将如何选择波长?

四大肠杆菌生长曲线的测定

1．通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。

2．复习光电比浊法测量细菌数量的方法。

（二）基本原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。

将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。

以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。

不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。

测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。

用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。

本实验用分光光度计（spectrophotometer）进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的od值，绘制生长曲线。

也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶（图15-5）测定“klettunits”值的光度计。

如图15—6所示，只要接种1支试管或1个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间（横坐标）取样测定，以测得的klettunits为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。

如果需要，可根据公式1klettunits=od/0.002换算出所测菌悬液的od值。

图15—5带侧臂试管的三角烧瓶

1．菌种大肠杆菌

2．培养基lb液体培养基70ml，分装2支大试管（5ml/支），剩余60ml装入250ml的三角瓶。

3．仪器或其他用具722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。

图15—6直接用试管测od值

1．标记

取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接种

分别用5ml无菌吸管吸取2.5ml大肠杆菌过夜培养液（培养10~12h）转入盛有50mllb液的三角瓶内，混合均匀后分别取5ml混合液放入上述标记的11支无菌大试管中。

3．培养

将已接种的试管置摇床37℃振荡培养（振荡频率250r/min），分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

4．比浊测定

用未接种的lb液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。

从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用lb液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1~0.65之内（测定od值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布）。

本操作步骤也可用简便的方法代替：

1．用1ml无菌吸管取0.25ml大肠杆菌过夜培养液转入盛有3~5mllb液的试管中、混匀后将试管直接插入分光光度计的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒将试管及比色暗室全部罩上，形成一个大的暗环境，另以1支盛有lb液但没有接种的试管调零点，测定样品中培养0h的od值。

测定完毕后，取出试管置37℃继续振荡培养。

2．分别在培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培养物试管按上述方法测定od值。

该方法准确度高、操作简便。

但须注意的是使用的2支试管要很干净，其透光程度愈接近，测定的准确度愈高。

（1）将测定的od600值填入下表：

培养时间对照01.534681012141620

光密度值od600

（2）绘制大肠杆菌的生长曲线。

（1）如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同？

两者各有什么优缺点？

（2）细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短？

若细胞密度为103/ml，培养4.5h后，其密度高达2×

108/ml，计计算出其代时。

（3）次生代谢产物的大量积累在哪个时期？

根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多？

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第三篇：

微生物学

《微生物学》课程建设工作总结

微生物学是我校生物技术、生物工程专业本科生的一门专业技术基础课，是较早开设的专业基础课，应为其它课程的教学打好基础，所以微生物讲授内容应该注重使学生牢固掌握微生物学的基本理论和基础知识，为今后的学习和工作打下宽厚的基础。

同时，微生物学又是一门飞速发展的学科，教师在课堂教学时应用现代观点审视教学内容，使学生在学习基础知识的同时获得一定量的最新信息，满足和激发学生的求知欲和主动学习的兴趣。

近年来，我们微生物学教研组在教学内容、教学方法和教学手段改革等方面进行了一些探索和实践，建立起一套比较完善的微生物学教学体系，切实提高了我校的微生物学教学水平。

一、微生物学教材建设和教学内容的重组与更新

（一）微生物学教材建设

教材是进行教学活动的重要基础，选取一本合适的教材对保证教学效果有相当重要的意义。

目前，针对各类高校不同专业教学要求编写的微生物学教材版本较多，各种教材内容侧重点也有很大的不同。

针对我校各类专业的教学要求，突出理工结合的专业特色，我们在选择和使用微生物学教材时进行了详细的调研和探索实践。

因此，在众多的教材中，我们尽量选择汇集学科近期研究进展、资料详实、信息量大、符合大纲要求、并适于教师教学和学生自学两方面需要的教材。

力求所选用的教材既能满足当前专业教学要求，又可为部分优秀学生报考其他高级院校相近专业硕士研究生考试作较全面的参考。

选用教材为教育部获奖教材及综合性大学考研指定教材——周德庆编写的《微生物学教程》（第二版），主要参考教材为面向21世纪课程教材——沈萍主编的《微生物学》和教育部高等教育司推荐、国外优秀生命科学教学用书——lansingm.prescott等编写的

《microbiology》（fifthedition）影印版，使我校微生物学教学站在较高的起点上，并为学生继续深造奠定了良好的基础。

（二）微生物学教学内容重组与更新

教材中教学内容的合理取舍及组织也是优化本门课程教学模式的重（更多精彩内容请访问首页）要环节。

针对各专业本科教学要求，微生物学在教学过程中存在“内容多，课时少”的矛盾，要求教师必须在深刻消化教材的基础上，根据实际情况进行教材和教学内容的重组与更新。

我们在认真了解我校学生相关的基础教育背景的基础上，根据本

校的相对优势、实际需要，大胆地对教材内容进行严肃而又认真的处理。

首先为克服教学内容交错重叠的现象，我们充分了解先行课普通生物学、生物化学等课程的教学内容，据此对微生物学教学内容和教学时间安排进行适当的调整，强化新知识，避免重复教学；

其次为突出理工结合的专业特色，适当补充“工业微生物学”教学内容。

例如：

将微生物的纯培养和显微技术纳入课堂教学；

在讲微生物的代谢时，结合代谢基本理论补充代谢的人工控制及其在发酵工业中的应用知识；

在课程的最后，根据专业特点，补充微生物工业和产品的相关内容等措施，既提高了学生学习微生物学的兴趣，又注重了学生实际能力的培养。

最后注意教学内容的更新和系统性，在教学过程中有意识地培养学生系统的思维能力。

根据教材在讲授基本理论、基本概念的前提下，适时适当地增添遗传工程育种新技术等新的研究成果和信息，对于教学内容的优化、拓宽学生的知识面也是十分必要的。

在教学过程中，不仅注意学科和学科之间的联系，而且要注意各个章节之间的联系，突出生命研究的系统性。

让学生掌握一个基本理论的同时，了解这一理论背后的科