响应面法优化茯苓多糖硫酸酯化合成工艺及其抗凝血活性分析Word下载.docx

响应面法优化茯苓多糖硫酸酯化合成工艺及其抗凝血活性分析Word下载.docx

《响应面法优化茯苓多糖硫酸酯化合成工艺及其抗凝血活性分析Word下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《响应面法优化茯苓多糖硫酸酯化合成工艺及其抗凝血活性分析Word下载.docx（6页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

抗凝血活性

　　中图分类号：

S567.3+2文献标识码：

A文章编号：

0439-8114（2015）23-5995-06

　　DOI：

10.14088/ki.issn0439-8114.2015.23.051

　　AnalysisofTheOptimizationofSulfationPachymaranSynthesisTechnologyProcessbyResponseSurfaceMethodandSulfationPachymaranAnticoagulantActivity

　　CHENXiao-hong

　　（CollegeofLifeScience，LongyanUniversity，Longyan364012，Fujian，China）

　　Abstract：

ThepachymanwasextractedfromtraditionalChinesemedicinePoriacocos，withaminosulfo-nicacidasesterificationreagent，treatedthepachymanwithsulfatedprocessingtomakesulfationpachymaran（SP）andoptimizedtheconditionsoftheirproductionprocessingbyresponsesurfacemethod.Afterpurification，structuralcharacterization，sulfationpachymaran（SP）wasexaminedtheanticoagulantactivitybytheanticoagulanteffecttestinmice.Experimentalresultsshowedthattheoptimalsulfatedprocessingofsulfationpachymaran（SP）wereasfollows：

reactiontime4.0h，chlorousulfonicacidandpyridinemassration3.77∶1，reactiontemperature85℃.Underthoseconditionsthedegreeofsubstitutionwas1.041，thedegreeofsubstitutionwasequalcomparedwiththemethodofchlorosulfonicacidpyridineinthesameconditions.TheSPhasthecharacteristicsofpolysaccharidesandsulfategroupabsorptionpeakinitsirspectrumafterrefined，theSPshowedhighpurityandnoimpuritiessuchasnucleicacids，proteins，andhadthecharacteristicsofsulfategroupabsorptioninitsUVscannedmap.GoodanticoagulantactivitywasshowedintheSP，itsBT，CTandCTextensionrateweresignificantlyimproved.TheeffectoninhibitionofthrombinwaspositivelyinteractionwithandSP’sconcentration，CTandCTextensionratewereobviouslyimprovedwiththedo-sageincreasedbyintraperitonealinjection.

　　Keywords：

Poriacocos;

sulfation;

pachymaran（SP）;

responsesurfacemethod;

anticoagulantactivity

　　中药茯苓（Poriacocos）为多孔菌科真菌茯苓的菌核，俗称云苓、松苓、茯灵，是寄生在松树根上的菌类植物，形状像甘薯，外皮黑褐色，里面白色或粉红色。

其原生物为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，菌核呈球形或不规则块状，大小不一。

茯苓味甘、淡，性平，入药具有利水渗湿、益脾和胃、宁心安神的功用[1]。

现代医学研究表明，茯苓多糖为中药茯苓的主要有效成分，但未经结构改性的茯苓多糖对肿瘤抑制率仅0.3%，活性低、水溶性差，难以利用，因此必须对原茯苓多糖进行相应的结构改性以提高其活性[2]。

对茯苓多糖进行硫酸酯化改性可得到硫酸酯化茯苓多糖（SP）[3]，硫酸酯化茯苓多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、增强机体免疫功能等多种生物学活性[4]。

多糖硫酸酯化的方法有Wolfrom法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氨基磺酸法等。

其中氨基磺酸法是目前较为优越的方法[5]，其硫酸酯化茯苓多糖的取代度可达到0.95，且避免了使用浓硫酸、氯磺酸、三氧化硫等强酸性物质，使反应安全性大大提高，能够显著地简化反应工艺，使工业化生产更环保。

因此，本试验以中药茯苓为原料通过稀碱浸提醇沉法获得茯苓多糖，以氨基磺酸为硫酸酯化试剂制备硫酸酯化茯苓多糖。

以硫酸酯化茯苓多糖的取代度为响应值，采用响应面法试验优化其制备条件，并对获得的硫酸酯化茯苓多糖进行纯化、结构表征，通过小白鼠体内抗凝血药效试验考察其抗凝血活性。

　　1材料与方法

　　1.1材料及仪器

　　中药茯苓购于龙岩市海华连锁药店;

氨基磺酸，广州市银霖化工有限公司;

二甲亚砜（DMSO），上海德茂化工有限公司;

氢氧化钠、无水乙醇，西陇化工股份有限公司。

所用试剂均为A.R.级。

　　琼脂糖凝胶电泳试剂：

电极缓冲液（pH6.8磷酸盐缓冲液）、染色液（0.01%甲苯胺蓝溶液）、指示剂（0.1%溴酚蓝溶液），脱色剂（醋酸∶乙醇∶水=0.1∶5.0∶5.0，体积比）[6]。

　　主要仪器：

LDZ5-2型离心机、BP221S型电子天平、UV-300型紫外光谱仪、琼脂糖凝胶电泳系统、岛津IR-400型红外光谱仪。

　　1.2方法

　　1.2.1茯苓多糖的制备将中药茯苓粉碎，过80目筛，得茯苓粉原料。

取原料20g，按如下过程操作：

原料→乙酸乙酯除酯类→热水回流浸提→浓缩得滤液→滤液活性炭脱色→真空旋转浓缩→Sevag除蛋白→3倍量95%乙醇沉淀、静置过夜→乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤→低温干燥→茯苓多糖[7]。

　　1.2.2SP的制备准确称取1g茯苓多糖，加入50mL二甲基亚砜溶解于500mL的平底烧瓶中，室温下搅拌10h，于油浴锅中加热升至反应温度60～120℃后加入适量氨基磺酸，磁力搅拌一定时间，得到的产物在冰水浴中冷却至0℃，然后用20%NaOH溶液调pH至7.0左右，加水至总体积为300mL，把样品转移至透析袋中，分别用自来水和蒸馏水透析2～3d，透析液减压浓缩至一定体积后用3倍量95%乙醇沉淀，再分别用丙酮、乙醚洗涤，沉淀、干燥，获得硫酸酯化茯苓多糖（SP）[5]。

　　1.2.3单因素试验

　　1）在氨基磺酸/多糖（质量比）为3∶1，反应温度80℃的条件下考察不同硫酸酯化反应时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）对SP硫酸基团取代度的影响。

　　2）取反应温度80℃、反应时间3.5h的条件下，考察不同氨基磺酸/多糖（2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，质量比，下同）对SP硫酸基团取代度的影响。

　　3）取反应时间3.5h、氨基磺酸/多糖为4∶1，考察不同硫酸酯化反应温度（60、70、80、90、100、110、120℃）对SP硫酸基团取代度的影响。

　　1.2.4响应面法优化工艺条件以反应时间、氨基磺酸/多糖质量比、反应温度3个因素进行工艺条件优化，经过单因素试验确定最佳水平，分别以3个因素为自变量，硫酸基团取代度为响应值，对多糖硫酸酯化条件采用响应面法中的Box-Behnken设计进行优化，其因素和水平见表1。

　　硫酸基团取代度（DS）的计算参照林标声[8]等的方法，公式为：

取代度（DS）=■，式中S为硫基百分含量。

　　1.2.5SP的精制取SP200mg注入SephadexG-100，蒸馏水平衡，上样，0.1mo/LNaCl洗脱，分管收集，用苯酚-硫酸法跟踪测定洗脱液，合并洗脱的多糖溶液，透析、减压、浓缩、干燥，得到精制的SP。

　　1.2.6SP的结构表征红外光谱分析：

以KBr为对照，取0.5gKBr分别与5.0mg茯苓多糖、5.0mgSP精制品研匀，制成薄片，采用红外光谱仪对其进行红外光谱扫描，以茯苓多糖为对照，分析SP的结构特征。

紫外光谱分析：

用双蒸水分别将茯苓多糖、SP精制品配置成1.0mg/mL的溶液，采用UV-300型紫外光谱仪对其进行光谱扫描，扫描范围400～190nm[9]。

　　1.2.7小白鼠体内抗凝血药效试验以生理盐水为空白，分别准确称取0.4g硫酸酯化茯苓多糖与茯苓多糖，将其超声分散溶解于40mL的生理盐水中，用于小白鼠腹腔注射给药。

取小白鼠于试验室饲养4d，随机分成3组：

空白组、Ⅰ组和Ⅱ组，每组取10只，空白组腹腔注射生理盐水，Ⅰ组腹腔注射茯苓多糖，Ⅱ组腹腔注射硫酸酯化茯苓多糖[10]，以30mg/kg剂量给药。

1次/6h为给药周期，共给药4次，于第四次给药2h后进行凝血试验，进行指标测定。

　　1）小白鼠全凝血时间（CT）及全凝血时间延长率的测定：

小白鼠尾静脉取血0.9mL，加3.8%柠檬酸三钠0.1mL，混合3000r/min离心分离15min，分离血浆。

取同一小白鼠0.1mL血浆3份分别装入3支试管中，于37℃水浴恒温5min。

之后在3支试管中分别加入0.025mol/L的氯化钙溶液0.1mL，分别记录3支试管内血液开始凝固所消耗的时间，取其平均值，测定全凝血时间并计算全凝血时间延长率[11]：

　　全凝血时间延长率=

　　■×

100%

　　2）小白鼠出血时间（BT）的测定：

腹腔注射给药20min后，将小白鼠尾尖5mm剪去，自尾部血液开始流出计时，每隔15s把小白鼠尾部的血用滤纸吸去，直至血液停止流出为止，所耗时间即为BT。

　　3）SP给药剂量对小白鼠全凝血时间（CT）及全凝血时间延长率的影响：

将SP分别以10、20、30、40、50mg/kg剂量对小白鼠腹腔注射给药，测定其全凝血时间并计算全凝血时间延长率。

　　2结果与分析

　　2.1硫酸酯化反应单因素试验结果

　　2.1.1硫酸酯化反应时间如图1所示，随硫酸酯化反应时间的延长，SP硫酸基团取代度迅速增大，当反应3.5h后硫酸基团取代度值达到最大1.02，继续延长反应时间硫酸基团取代度值不变，说明反应3.5h后茯苓多糖的硫酸酯化反应达到平衡。

因此，茯苓多糖的硫酸酯化最优反应时间取3.5h。

　　2.1.2氨基磺酸/多糖如图2所示，氨基磺酸/多糖（质量比）为4∶1时，SP的硫酸基团取代度值达到最大，因此，取氨基磺酸/多糖最适质量比为4∶1。

　　2.1.3硫酸酯化反应温度如图3所示，硫酸酯化反应温度的升高有利于茯苓多糖的硫酸酯化，主要是由于温度升高有利于氨基磺酸分解生成SO3，促进茯苓多糖的硫酸酯化，反应温度达到80℃时，SP的硫酸基团取代度值最大，其值为1.02。

反应温度高于90℃时，SP的硫酸基团取代度值反而降低，主要可能是高温破坏了茯苓多糖的结构，引起多糖降解，导致SP的硫酸基团取代度值降低。

因此，茯苓多糖的硫酸酯化最适反应温度为80℃。

　　2.2响应面法优化氨基磺酸硫酸酯化多糖条件

　　按Box-Behnken优化的反应条件进行SP的制备，测定不同制备条件下获得的SP的硫酸基团取代度值，结果见表2，对试验结果进行回归分析，结果见表3。

　　由表3可知，模型的F值为4.56，表明该模型是显著的，模型分析具有统计学意义。

对表2的试验结果进行回归分析得到方程：

DS=-1.30175+0.043525A+0.3495B-0.0905C-（1.75E-3）AB+（2.00E-3）AC-（5.00E-3）BC-（2.65E-4）A2-0.024B2-（6.00E-3）C2。

方程的R2=0.9643，说明方程的拟合程度较好，通过方程可以很好地预测试验结果，模型的“Prob>

F”&

lt;

0.05、失拟项的P=0.0648>

0.05不显著，表明模型的可信度高，可以通过该模型优化氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的工艺条件。

对不同的影响因素进行响应面分析，结果如图4、5、6所示。

　　由响应面分析法优化得到氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖最优工艺∶反应温度为84.75℃，氨基磺酸∶茯苓多糖质量比为3.77∶1，反应时间为4.0h，在此条件下SP的取代度DS达到1.045。

　　2.3氨基磺酸硫酸酯化多糖优化条件的验证

　　对优化结果的可靠性进行验证，取反应温度为85℃，氨基磺酸∶茯苓多糖（质量比）为3.77∶1，反应时间为4.0h进行硫酸酯化反应，平行试验4次，结果取平均值，测得SP的取代度DS的值为1.041，与模型预测值基本一致，表明模型的可信度高，能够很好地指导氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的反应。

　　在相同条件下，以氯磺酸-吡啶为硫酸酯化试剂，取氯磺酸∶吡啶摩尔比1.385∶1对茯苓进行硫酸酯化反应[12]，平行试验4次，结果取平均值，测得SP的取代度DS的值为1.021。

表明氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的结果与氯磺酸-吡啶法相当。

　　2.4SP的结构表征

　　比较茯苓多糖和SP的红外光谱图（图7）表明，SP除了具有茯苓多糖的相同的特征吸收峰外，还具有C-O-S（805nm）、S=O（1220～1250nm）的特征吸收[13]，表明以氨基磺酸为硫酸酯化试剂对茯苓多糖的硫酸酯化方法是可行的。

　　对比茯苓多糖和SP的紫外光谱图（图8、图9）可知，SP除了在268nm左右有-S-O-和-SO2的吸收峰外，光谱图与茯苓多糖相似，说明SP无核酸、蛋白质等杂质，纯度较高，且有硫酸根基团的特征吸收，硫酸酯化成功。

　　2.5SP的抗凝血药效试验结果

　　茯苓多糖硫酸酯化结构改性前后的抗凝血药效试验结果见表4，结果表明腹腔注射小白鼠SPⅡ组的全凝血时间为（122±

13）s、出血时间为（193±

12）s，全凝血时间延长率为43.5%，均明显高于腹腔注射茯苓多糖Ⅰ组的全凝血时间、出血时间、延长率。

SP在小白鼠体内腹腔注射给药剂量对抗凝血活性的影响见表5。

由表5可知，随SP给药剂量的增大，小白鼠的全凝血时间、全凝血时间延长率相应增大，表明SP对小白鼠体内凝血酶产生的抑制作用与其浓度呈正相互作用。

茯苓多糖经硫酸酯化结构改性后表现出良好的抗凝血活性。

　　3小结

　　以中药茯苓为原料通过稀碱浸提醇沉法获得茯苓多糖，以氨基磺酸为酯化试剂对所获得的茯苓多糖进行硫酸酯化结构改性，制备硫酸酯化茯苓多糖，试验方法可行，试验结果与氯磺酸-吡啶法相当。

响应面法优化氨基磺酸硫酸酯化茯苓多糖的反应条件，得到最佳工艺为反应温度85℃、反应时间4.0h、氨基磺酸/多糖质量比为3.77∶1，在此条件下，硫酸基团取代度为1.041，与同样条件下氯磺酸吡啶法制备的取代度1.021值相当。

经SephadexG-100柱层析精制后，红外图谱表明SP具有C-O-S（805nm）、S=O（1220～1250nm）的多糖及硫酸根基团的特征吸收峰。

紫外光谱扫描表明，SP无核酸、蛋白质等杂质，纯度较高，且有268nm左右的-S-O-和-SO2的硫酸根基团的特征吸收，表明硫酸酯化成功。

茯苓多糖经硫酸酯化结构改性后表现出良好的抗凝血活性，其全凝血时间、出血时间、全凝血时间延长率均明显提高;

随着小白鼠腹腔注射给药剂量的增大，其全凝血时间、延长率均相应明显提高，SP对凝血酶产生的抑制作用与其浓度呈正相互作用。

　　参考文献：

　　[1]付玲，于森.茯苓研究的新进展[J].新疆中医药，2005，23（3）：

79-83.

　　[2]黄才欢，李炎，王秀芬.茯苓多糖的提取及其结构表征[J].广州食品工业科技，2003，17（3）：

13-15.

　　[3]淡新提，王艺峰.化学修饰的茯苓多糖抗肿瘤效应的组织学观察[J].武汉大学学报（医学版），2004，25（6）：

652-654.

　　[4]张璐，刘强.茯苓多糖制备工艺及药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2006，12（4）：

61-63.

　　[5]陈群.茯苓硫酸酯化多糖的制备及其核磁共振波谱分析[J].安徽农业科学，2010，38

（1）：

45-47.

　　[6]朱奎礼，陈涛，陈浩.硫酸化香菇多糖的琼脂糖电泳鉴别[J].中国生化药物杂志，2004，25（6）：

356-357.

　　[7]周燕霞，唐明林，殷辉安，等.茯苓中多糖的提取及含量测定[J].天然产物研究与开发，2003，15（4）：

330-333.

　　[8]林标声，罗茂春.发酵液中硫酸酯化茯苓多糖（SP）的制备及其结构改性的研究[J].食品科技，2010，35

（2）：

130-137.

　　[9]林标声，杨生玉，姜辉，等.茯苓液体培养法中羧甲基茯苓多糖（CMP）的提取、纯化及鉴定[J].河南大学学报（自然科学版），2008，38（3）：

275-280.

　　[10]陈群.口服茯苓多糖硫酸酯前体脂质体的制备及其抗凝血活性研究[J].合肥学院学报（自然科学版），2013，23（4）：

47-50.

　　[11]赵锐，郭彩霞，张鸥，等.玉米芯多糖及其硫酸酯抗凝血活性及其机制[J].吉林大学学报（医学版），2012，38

（1）：

62-65.

　　[12]韩勇.茯苓菌丝体胞外多糖硫酸酯化工艺的研究[J].太原师范学院学报（自然科学版），2013，12

（1）：

130-134.

　　[13]王兆梅，李琳.活性多糖构效关系研究评述[J].现代化工，2002，22（8）：

18-21.