利用TRIzol试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNAWord格式.docx

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1、胰高血糖素、胰α2淀粉酶、

β2actinRT2PCR

产物电泳结果显示均有清晰的条带。

结论　应用

试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总

RNA,后者

可用于

RT2PCR研究。

关键词

大鼠胰腺

总

RNA提取

TRIzoló

试剂

液氮

中图分类号

Q813　　　文献标志码

A　　　文章编号

167128259（2009）0520639204

RENWu2chao1,2,WANGXuan1,2,WANGFei2miao1,2

HANYan1,2,NINGQi2lan1,2,SONGTian2bao1,3

（1.KeyLaboratoryofEnvironmentandGenesRelatedtoDiseases,

MinistryofEducationofChina/

AmethodwithTRIzoló

reagentandliquidnitrogento

extracthigh2qualityRNAfromratpancreas

LIDong2min1,2,GAOYu1,2,

LBShe2min1,2

MedicalSchoolofXipanJiaotongUniversity,Xipan710061;

2.DepartmentofGeneticsandMolecularBiology,MedicalSchoolof

XipanJiaotongUniversity,Xipan710061;

3.DepartmentofHumanAnatomy,

HistologyandEmbryology,MedicalSchoolofXipanJiaotongUniversity,Xipan710061,China）

ABSTRACT:

Objective　Toestablishaquick,economicalandreproduciblemethodforhigh2qualityRNA

extractionfrompancreas.Methods　WeutilizedTRIzol

ó

ReagentandliquidnitrogentoisolatetotalRNAfrom

theratpancreas.TheRNAqualitywasdeterminedbydetectionofitscontentandopticdensity（A）at260/280nm,

andelectrophoresisin1%non2denaturedagarosegel.Thenreversetranscription2polymerasechainreaction（RT2

PCR）wasperformedtodetectexpressionofthepancreas2specificgenes.Results　ThecontentofthetotalRNA

extractedfromtheratpancreasreached3-6μg/mgpancreatictissues,andA260/280ratiowas1.75-1.89.

ElectrophoresisofthetotalRNAshowed28Sand18SrRNAbandswithclearsmearbetweenthem.TheRT2PCR

productsofpancreas2specificgenesincludinginsulin1,glucagon,α2amylaseandhousekeepinggeneβ2actinall

exhibitedclearbandson1%agarosegel,whichwerelocatedintheexpectedpositions,respectively.Conclusion　

Theseresultssuggestthatwehavesuccessfullyisolatedthehigh2qualityandintactRNAfromtheratpancreaswith

TRIzol

Reagentandliquidnitrogen.TheextractedtotalRNAcanbeusedinRT2PCRforpancreaticgeneexpres2

sion.

KEYWORDS:

ratpancreas;

totalRNAextraction;

TRIzol

reagent;

liquidnitrogen

收稿日期

2008212223　　修回日期

2009203218

基金项目

国家自然科学基金资助项目

（No.30400249;

30571725;

30630058）;

陕西省国际科技合作重点项目

（No.20072KW206）;

陕西省自然科学

基金资助项目

（No.2004C256）;

陕西省卫生厅基金资助课题

（No.D204028）

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.30400249;

30571725;

30630058）,theInternationalCooperational

FoundationofShaanxiProvince（No.20072KW206）,theNaturalScienceFoundationofShaanxiProvince（No.2004C256）,andthe

FoundationofHealthDepartmentofShaanxiProvince（No.D204028）.

通讯作者

宋天保

教授

博士生导师

.E2mail:

songtbao@;

吕社民

.E2mail:

lushemin@mail.xjtu.edu.cn

作者简介

（19702）,女

（汉族

）,博士

.研究方向

2型糖尿病等代谢性疾病的分子发病机制

.

6　　　　　40西安交通大学学报

）第

30卷

1968年

COX用盐酸胍代替酚作为蛋白质变性

剂

建立了分离纯化

RNA的方法。

1979年

CHIR2

GWIN成功地利用异硫氰酸胍裂解、并以氯化铯为

基质经超高速离心从富含核糖核酸酶的组织中

分离

到未降解的

RNA,并成为当时提取

RNA的主要方

法。

1987年

CHOMCZYNSKI和

SACCHI在联合

应用异硫氰酸胍和酚提取

RNA的基础上

建立了用

酸性异硫氰酸胍

2酚2氯仿抽提一步法分离

RNA的方

法

由于省略了以氯化铯为基质经超高速离心这一步

骤

分离

RNA的时间缩短为

4h,不但使

RNA的产

量和纯度大大提高

而且还可从微量的细胞和组织中

提取

RNA。

这种提取

RNA的方法被广泛应用

并

且被商业化。

尽管目前已能成功地从原核生物、真核

生物的多种组织和细胞中提取

RNA,但由于胰腺易

自溶和富含内源性核糖核酸酶

[1],导致很难获得高质

量的胰腺

RNA,给研究胰腺组织的基因表达带来很

表

1　大鼠胰腺中表达的

4个基因的引物序列和扩增片段大小

大困难。

我们经过反复试验

利用

试剂和液

氮从大鼠胰腺组织中成功提取完整的

RNA,可用于

RT2PCR、Northernblotting、差异显示、抑制性消减

杂交及芯片等的研究。

1　材料与方法

1.1　实验动物　

SPF级

E3雌性大鼠

4只

体重

220～250g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.2　主要试剂及仪器　

（Invitrogen公

司）;

反转录试剂盒

RevertaidTMFirstStrandcDNA

Synthesis（Fermentas公司

）;

TaqDNApolymerase

（TaKaRa公司

）。

蛋白核酸定量仪

CE2321

（GENEGUEST）;

凝胶成像系统

（SYNGENE）;

PCR

热循环仪

PTC2200（BIO2RAD）。

用

PrimerPrimier

5.0设计

PCR引物

并由上海桑尼生物科技有限公

司合成

引物序列见表

1。

2AGCAAGCAGGTCATTGTTCC23′

2TTGCGGGTCCTCCACTTC23′

2ACCGTTTACATCGTGGCT23′Senseprimer:

5′

Antisenseprimer:

Senseprimer:

Tab.1　TheprimersequenceandsizeofPCRproductsofthe4genesexpressedintheratpancreas

GenePrimersequence

SizeofPCRproducts

Insulin1209bp

Glucagon

492bp

2GTCTCTGGTGGCAAGGTTAT23′

2ACATTGGTGTAGCAGGGTT23′

α2amylase

318bp

2CAAGGGCTCTGTCAGTAGG23′

5′2CACCCGCGAGTACAACCTTC23′

β2actin207bp

5′2CCCATACCCACCATCACACC23′

1.3　大鼠胰腺的取材和保存　取材所用的器械

180

℃干烤

6h,不能干烤的塑料制品用

1mL/LDEPC

水

37℃处理过夜

高压烤干后备用。

戊巴比妥钠麻

醉

E3大鼠

快速取胰腺尾部组织约

20～30mg,装

入

DEPC处理过的冻存管中

液氮中保存或液氮速

冻后

-80℃保存备用。

1.4　利用

和液氮提取大鼠胰腺总

RNA　

将胰腺组织从液氮或

-80℃低温冰箱中取出

立即

放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末

研磨过

程中始终保持研钵内有液氮。

然后

将胰腺组织粉末

移入

1.5mL的

EP管中

加入

1mLTRIzoló

剧烈

震荡

30s,并在室温放置

5min。

加入

0.2mL氯仿

剧烈振荡

15s,室温放置

3min,4℃12000×

g离心

15min,样品分为

3层

上层无色水相

下层粉红色有

机相

中间白膜层。

将上清转移至另一新的

DEPC

处理过的

1.5mLEP管中

（此步绝对不能吸入中间

白膜层

）,加入

0.5mL异丙醇

混匀后

-20℃放置

30min。

4℃12000×

10min,弃去上清

用

750mL/L乙醇洗涤

RNA胶样沉淀。

4℃

7500×

g

离心

5min,室温放置

10～15min干燥

60μL

DEPC水溶解

RNA沉淀后

280℃保存。

若长期保

存

RNA也可用无

RNA酶的去离子甲酰胺溶解。

1.5　大鼠胰腺总

RNA定量及

A260/280比值鉴定　用

99μLDEPC水稀释总

RNA1μL后

用核酸

/蛋白质

微量定量仪检测大鼠胰腺总

RNA的含量及

A260/280

比值。

1.6　10g/L非变性的琼脂糖凝胶电泳检测大鼠胰

腺总

RNA　电泳

RNA所用器械如制胶的模具、梳

子、电泳槽等用

30mL/L过氧化氢溶液浸泡

30min,

DEPC水冲洗

3遍

室温晾干备用。

用对

RNA酶

有抑制作用的

DEPC水配置电泳缓冲液

TAE及其

他所有溶液。

用新的

0.5×

TAE配制

10g/L琼脂糖

凝胶

溴化乙锭

（EB）直接加入凝胶中。

点样时

样品

RNA每

2.5μL加入

0.5μL6×

上样缓冲液

以

5V/cm电压电泳

30min左右取出凝胶

在凝胶成像

系统观察所提取的

RNA并拍照记录。

1.7　RT2PCR法检测胰岛素

1、胰高血糖素、胰α2淀

粉酶和

β2actin的表达　按照

RevertaidTMFirst

5期李冬民

任吴超

王　璇

等.利用

RNA

StrandcDNASynthesisKit操作说明

反转录合成

cDNA第一链。

逆转录反应体系总体积

20μL,含胰

RNA5μg、M2MULV逆转录酶

（200u/μL）

1μL。

cDNA合成后保存在

-80℃冰箱中备用。

PCR扩增大鼠胰岛素

1、胰高血糖素、胰α2淀粉

酶和

β2actin:

取高压灭菌的

0.2mL的

PCR小管

4

支

分别依次加入

10×

PCRBuffer2.5μL、dNTP

Mixture（各

2.5mmoL/L）2μL、TaqDNApoly2

merase（5u/μL）0.125μL、上下游引物各

1μL、cD2

NA0.5μL、灭菌蒸馏水

17.875μL,反应总体积

25μL。

混匀后

短暂离心。

反应条件

94℃

5min,

94℃1min,60.3℃

1min,72℃

1min延伸

共

32

个循环

最后

72℃10min。

产物鉴定

取

20μLPCR

扩增产物在

10g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定

用凝胶

成像系统进行分析。

2　结　　果

2.1　大鼠胰腺总

RNA定量、

A260/280比值及

10g/L

非变性琼脂糖凝胶电泳结果　利用TRIzoló

试剂和

液氮提取的4只E3大鼠胰腺总RNA量可达到3～6

μg/mg胰腺组织,A260/280比值在1.75～1.89之间。

在10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳时,均可见28S及

18S条带,28S与18S条带灰度比值大于1.8,并且在

28S和18S条带间可见明显的云雾状阴影（图1）。

RNA的提取是分子生物学中最常用的操作技术

之一。

由于mRNA分子容易受到核糖核酸酶的破坏

而降解,加上核糖核酸酶广泛存在且极为稳定,因此

图

1　利用

试剂和液氮提取的大鼠胰腺总

的

10g/L非变性琼脂糖凝胶电泳

Fig.110g/Lnon2denaturedagarosegelelectrophoresisof

thetotalRNAisolatedfrompancreasof4E3rats（1-4）

withTRIzoló

reagentandliquidnitrogen

2.2　RT2PCR法检测大鼠胰腺特异性基因的表达　

RT2PCR产物的

10g/L琼脂糖凝胶电泳结果显示

大

鼠胰腺特异性表达基因胰岛素

1（209bp）、胰高血糖素

（492bp）和胰

α2淀粉酶

（318bp）以及管家基因

β2actin

（207bp）均有清晰的条带

未见非特异性扩增

（图

2）。

2　大鼠胰腺特异性表达基因

琼脂糖凝胶电泳

Fig.2RT2PCRanalysisofproductsofpancreas2specific

genesfromratpancreason10mL/Lagarosegel

M:

DNAmarker;

1:

insulin1;

2:

glucagon;

3:

amylase;

4:

beta2

actin

3　讨　　论

抑制核糖核酸酶的活性成为

RNA提取过程中的关

键问题。

常规的组织和细胞

RNA的提取要求所有

与

RNA接触的仪器和装置都要严格处理

以尽量减

少外源性

RNA酶污染造成的

mRNA降解

[2]。

然而

对于易于自溶和富含内源性

RNA酶的胰腺组织的

常规方法因不能完全抑制

RNA酶活性

而使胰腺

RNA的提取失败。

目前

仅有少量文献报

道胰腺组织的

RNA提取方法

主要有两种

①原位

胰腺导管灌注

RNA酶抑制剂

然后提取

RNA[3];

②

将新鲜胰腺组织样品保存于

RNAlater2ICE中

用液

氮或干冰速冻后

提取

RNA[425]。

第一种方法由于胰

腺导管灌注成功与否是提取胰腺完整

RNA关键

因

而要求有很高的导管穿刺技术

穿刺失败

则前功尽

弃

因而重复性差

第二种方法也是目前研究中主要

用的方法

但由于所用试剂较多

步骤繁琐

也不容易

在众多实验室推广。

商业所售的

试剂提取总

RNA,实质上

是酸性异硫氰酸胍

RNA[6]。

按照

试剂操作步骤通过匀浆可非

常容易地提取多种组织的

如果直接用匀浆法

破碎富含核糖核酸酶的胰腺组织

由于胰腺组织中的

细胞不容易迅速与裂解液

试剂充分接触

RNA酶不能迅速被灭活而致提取的

RNA降解。

因

此

在抑制

RNA酶活性的同时

使组织充分的裂解

6　　　　　42西安交通大学学报

降解问题也就迎刃而解。

RNA酶活性在低温环境

（液氮、干冰

）或

RNA酶抑制剂中可被完全抑制

[728],

与干冰和

RNA酶抑制剂相比

液氮具有更经济、易

于获得的优点。

在研究中

我们利用

试剂和液氮经过

50余次的实践

最终成功提取了大鼠胰腺高质量的

A260/280比值测定和

非变性琼脂糖凝胶电泳结果均提示

所提取的大鼠胰

RNA没有降解

完整性很好。

为了进一步鉴定

所提取的

mRNA的质量及其是否可以用于下游实

验

如

RT2PCR、Northernblotting、差异显示、抑制

性消减杂交、芯片等的研究

我们选用

RT2PCR检测

了大鼠胰腺特异性基因的表达。

结果显示

不但管家

基因

β2actin条带清晰

而且胰腺内分泌部特异性表

达基因胰岛素和胰高血糖素以及外分泌部特异性表

达基因胰

在

marker所指示的位置均有清

晰的条带

没有非特异性扩增条带。

在设计引物时

我们特别注意选择位于不同外显子上的上下游引物

从而保证了RT2PCR模板来源于mRNA反转录后

的cDNA,而非DNA。

利用TRIzoló

和液氮提取大鼠胰腺高质量总

RNA的方法,不但经济、简单方便,而且重复性好。

但在具体操作中有几点要特别注意:

①取胰腺组织的

动作一定要快;

②胰腺组织在-80℃保存前一定要

用液氮速冻;

③研磨过程中要及时添加液氮,保证胰

腺组织在研磨时一直浸在液氮中,防止mRNA降解;

④反转录时也要避免外源性RNA酶的污染。

[J].JVirolMethods,2001,94（12