Restrictionendonucleaseenzymedigestion限制内切酶Word格式.docx
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制酶名稱的第三個字母之後。
例如限制酶HincⅡ和HindⅢ則是分別來自流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的c和d血清型菌株。
●限制酶的種類
Ø
已知的限制酶分為TypeI、TypeII與TypeIII三類。
TypeI與TypeIII限制酶同時具有endonuclease與methylase的活性。
TypeI限制酶會隨機的切割距離辨識位置~1000bp的序列,TypeIII則只會切割距離辨識位置24~26bp的序列。
TypeII限制酶,則會專一地切割所辨識的核酸序列的位置,一般可辨識雙股DNA上特定的4~8個鹼基,並能在認知序列內的特定位點上切割雙股螺旋DNA。
每一種限制酶能辨識一特定的DNA序列並加以切割,但它不會切割細菌自己的DNA,因為細菌DNA上的切割位置已被甲基化,稱為restriction-modificationsystem。
不同的細菌中可純化出具不同專一性的限制酵素,可用來做基因剪接時的「剪刀」,使其成為基因或分子遺傳操作上極為有用的工具,目前被廣泛應用於遺傳工程、基因選殖(cloning)和基因圖譜分析(genemapping)。
第一型限制酶
同時具有修飾(modification)及認知切割(restriction)的作用;
另有認知(recognize)DNA上特定鹼基序列的能力,通常其切割位(cleavagesite)距離認知位(recognitionsite)可達數千個鹼基之遠,並不能準確定位切割位點,所以並不常用。
例如:
EcoB、EcoK。
第二型限制酶
只具有認知切割的作用,修飾作用由其他酵素進行。
所認知的位置多為短的迴文序列(palindromesequence);
所剪切的鹼基序列通常即為所認知的序列。
是遺傳工程上,實用性較高的限制酶種類。
EcoRI、HindIII。
第三型限制酶
與第一型限制酶類似,同時具有修飾及認知切割的作用。
可認知短的不對稱序列,切割位與認知序列約距24-26個鹼基對,並不能準確定位切割位點,所以並不常用。
EcoPI、HinfIII。
第II型限制酶
第II型限制酶只會辨認特定短的DNA序列,因此廣泛被應用於基因工程的技術上,目前商品化的產品很多,可由生技公司購得。
此種限制酶會辨認長度4~6bps(或更長)等不同的核苷酸序列,很準確的在某一點上切DNA成對稱的兩軸交互分開,這種交互切口會使DNA片段的5’和3’懸空成stickyend(orcohesiveend突出端)
常見的內限制酶及其辨認的切位
酵素名稱
來源
辯識序列
切法
EcoRI
Escherichiacoli
5'
GAATTC
3'
CTTAAG
---GAATTC---3'
---CTTAAG---5'
BamHI
Bacillusamyloliquefaciens
GGATCC
CCTAGG
---GGATCC---3'
---CCTAGG---5'
HindIII
Haemophilusinfluenzae
AAGCTT
TTCGAA
---AAGCTT---3'
---TTCGAA---5'
TaqI
Thermusaquaticus
TCGA
AGCT
---TCGA---3'
---AGCT---5'
NotI
Nocardiaotitidis
GCGGCCGC
CGCCGGCG
---GCGGCCGC---3'
---CGCCGGCG---5'
HinfI
GANTC
CTNAG
---GANTC---3'
---CTNAG---5'
Sau3A
Staphylococcusaureus
GATC
CTAG
---GATC---3'
---CTAG---3'
PovII*
Proteusvulgaris
CAGCTG
GTCGAC
---CAGCTG---3'
---GTCGAC---5'
SmaI*
Serratiamarcescens
CCCGGG
GGGCCC
---CCCGGG---3'
---GGGCCC---5'
HaeIII*
Haemophilusegytius
GGCC
CCGG
---GGCC---3'
---CCGG---5'
AluI*
Arthrobacterluteus
---AGCT---3'
---TCGA---5'
EcoRV*
GATATC
CTATAG
---GATATC---3'
---CTATAG---5'
KpnI
Klebsiellapneumonia
GGTACC
CCATGG
---GGTACC---3'
---CCATGG---5'
PstI
Providenciastuartii
CTGCAG
GACGTC
---CTGCAG---3'
---GACGTC---5'
SacI[
Streptomycesachromogenes
GAGCTC
CTCGAG
---GAGCTC---3'
---CTCGAG---5'
SalI[
Streptomycesalbue
---GTCGAC---3'
---CAGCTG---5'
SphI
Streptomycesphaeochromogenes
GCATGC
CGTACG
---GCATGC---3'
---CGTACG---5'
XbaI
Xanthomonasbadrii
TCTAGA
AGATCT
---TCTAGA---3'
---AGATCT---5'
*=平滑末端(bluntends)/鈍端切割(bluntend);
其餘為黏滯切割(stickyend)
限制酵素的使用
1.單一酵素使用:
注意buffer
2.兩種不同限制酵素以上一起使用:
選擇可使兩種酵素活性反應達75%以上的buffer
●先加低鹽的buffer作用一酵素,再加入高鹽的buffer作用另一酵素
3.當有多個樣品要用相同的酵素處理:
配mastersolution
●
4.Inactivationofrestrictionenzyme:
●heat
●phenol/chloroform/isoamylalcohol
Star-activity:
指限制酵素對所作用的DNA及序列失去專一性。
當酵素辨認切割位的能力降低,導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用,如六個變成只認四個,而產生錯誤的結果。
原因
✓pH值過高(>8.0)
✓離子濃度過低(<25mM)
✓高glycerol濃度(>5%v/v)
✓溶液中含有機溶液(如DMSO,酒精等)
✓Mg+2被其他二價陽離子取代(如Mn+2,Cu+2,Co+2,Zn+2等)
✓酵素(unit)與DNA重量(ug)的比例過高(每種酵素比例不同,但一般在>100u/ug時)
4、材料與設備:
A.材料:
質體:
pBac-D-Pn539-E、pET-21(+)
酵素:
RNaseA
Restrictionenzymes
EcoRI20U/μlbufferEcoRI
BamHI20U/μlbufferBαmHI
B儀器:
離心機、37℃的水浴槽
5、問題與討論
A.
請詳細說明限制酵素三種type的特性?
功能:
限制、修飾
特點:
需Mg2+、ATP和S-腺苷蛋氨酸為輔助因數;
識別位點和切割位點不一致,無固定切割位點;
應用:
不常用。
識別並特異切割DNA分子。
即通常所指DNA限制性核酸內切酶;
反應特點:
僅需Mg2+作催化反應輔助因數,能識別雙鏈DNA特殊序列,並可特異切割DNA,產生特異片段;
種類繁多,分子克隆中最為常用
特異切割,切割位點在距識別位點3`端24-26bp處。
數量很少,無實際作用。
B.
(1)何為restriction-modificationsystem?
(2)細菌如何抵抗phage?
(3)限制酵素為何不會切自己的DNA?
(1)大多數限制性內切酶常常伴隨有1~2種修飾酶(DNA甲基化酶),後者能保護細胞自身的DNA不被限制性內切酶破壞。
修飾酶識別的位點與相應的限制性內切酶相同,它們的作用是甲基化每條鏈中的一個鹼基,而不是切開DNA鏈。
甲基化所形成的甲基基團能伸入到限制性內切酶識別位點的雙螺旋大溝中,阻礙限制性內切酶發揮作用。
這樣,限制性內切酶和它的“搭檔”修飾酶一起組成R-M系統。
在某些R-M系統中,限制性內切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白,它們各自獨立行使自己的功能;
另一些R-M系統本身就是一種大的限制-修飾複合酶,由不同亞基或同一種亞基的不同結構域來分別執行限制或修飾的功能。
1.定義
限制修飾系統(Restrictionmodificationsystem或R-M系統)是一種存在於細菌(可能還有其他原核生物),可保護個體免於外來DNA(如噬菌體)侵入的系統,主要由限制內切酶和甲基化酶組成的二元系統。
2.結構編
細菌的限制修飾系統包含三個連鎖基因:
(1)hsdR:
編碼限制性核酸內切酶
(2)hsdM:
編碼限制性甲基化酶
(3)hsdS:
編碼限制性酶和甲基化酶的協同表達
3.作用機制
有些細菌體內含有限制酶,可將雙股DNA切斷,之後其他的內切酶再將切下的片段降解,因此能將入侵的外來DNA摧毀;
有些病毒則演化出對抗此系統的機制,它們的DNA經過了甲基化或糖基化的修飾,可阻礙限制酶的作用;
另外還有一些病毒,如T3及T7噬菌體,則合成出一些可抑制限制酶的蛋白質;
而為了進一步對抗病毒,有些細菌演化出專門辨識並切割已修飾DNA的限制系統。
(2)宿主菌對噬菌體的天然抵抗機制分為4個主要的類別:
吸附抑制、流產感染、限制-修飾系統和穿入阻滯。
1.吸附抑制(absorptioninhibition)
最有效的防禦即是阻止phage與其之間的任何物理性接觸,這可以通過細菌細胞壁上phage的受體突變,或者可以更有效地通過分泌阻止phage接近的屏障,如:
莢膜、黏液層來實現。
ex:
通常情況下Tphage可以吸附在E.coliB和K-12細胞壁的特殊位點上並進行轉錄,E.coliB和K-12的一些突變株在細胞壁上表達過多的多糖莢膜,這些過多的莢膜覆蓋了細胞壁上phage的受體位點,從而產生了對Tphage的抵抗作用;
而抑制莢膜形成的E.coliB和K-12的11011.9的突變株就能抑制Tphage的抵抗作用,該突變株可能由發生在non-9的等為基因上的組蛋白相關的突變形成。
2.流產感染(abortiveinfection/Abi)
流產感染(AbortiveinfectionAbi)系統(也稱噬菌體排斥系統)是在噬菌體的不同發育階段干擾噬菌體增殖的一種機制。
在噬菌體感染的過程中,噬菌體的吸附和DNA注入正常發生,只是後續發生的噬菌體發育過程被終止。
由於噬菌體的侵入,幹擾了宿主細胞的正常生理功能,導致了被感染宿主細胞的死亡,進而終止了噬菌體的增殖,被感染細胞的死亡阻止了噬菌體的擴散,為周圍細胞的生存提供了保護。
Abi系統多數編碼在質粒或前噬菌體上,常常由單一宿主基因所介導。
在λ噬菌體溶源性的大腸桿菌中發現的Rex系統是目前為止研究最清楚的Abi系統
3.restriction-modificationsystem
限制修飾(Restriction-ModificationRM)系統是最早發現的細菌免疫系統,典型的RM系統由限制酶(REase)和甲基轉移酶(MTase)構成,它們通常成對出現,具有相同的DNA識別位點。
REase識別並裂解特定的DNA序列,同源的MTase對同一識別位點上的腺嘌呤或胞嘧啶進行甲基化,保護DNA不被REase裂解。
正常情況下,含有RM的細胞在DNA複制過程中被甲基化,而外來核酸(如噬菌體和質粒DNA)的甲基化模式與細菌本身的甲基化模式不一致,就可能被細菌的特定限制酶所降解。
編碼RM系統的基因定位在質粒或染色體基因組中。
RM系統是細菌免疫防禦的胞內第一道防線。
在噬菌體或移動遺傳元件尚未複製之前就降解其DNA是RM系統作用的突出特點之一。
4.穿入阻滯
由pNP40的編碼的早期發生作用的phage抵抗機制,可以排除經典的吸附受阻、restriction-modificationsystem、流產感染(pNP40同時還編碼流產感染機制),他可以被以下幾個證據支持:
Phage吸附到MG1614/pNP40與其吸附到敏感宿主上有相同的吸附效率,電鏡觀察發現這種附著是用正常的尾先定方向進行的
感染結果只有10﹪的含pNP40宿主菌死亡,提示這種pNP40編碼的抵抗機制的作用必定先於受感染後宿主功能的喪失和DNA的降解
Phage基因組進入含有pNP40的宿主後的內在化被延遲或削弱,這即是至少在感染後30min內不能檢測到phage特意DNA的證據,而在敏感宿主中感染後5min即能檢測到
通過電穿孔將phageDNA引入抵抗宿主中造成是感染後早期階段假象也能到ECO
的顯著增加,這支持早期即發生作用的pNP40編碼的抵抗作用在phageDNA穿入細胞階段上發揮作用的觀點
(3)因為當細胞內含有某種限制性內切酶時,細胞本身會有相應的保護措施。
比如細胞基因組中沒有該限制性內切酶能識別序列的序列(這種情況應該是比較少的);
主要的是細胞內能通過甲基化修飾來保護自身DNA不被自身限制性內切酶酶切。
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