支气管肺泡灌洗BAL的临床应用与实验室检查Word文档格式.docx
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24小时内,于相关肺野
喘息
高敏病人1-2周
发烧
10-30%BAL几小时后,可能与TNF-介导有关
肺功能损害
FEV1,VC,PEF,PaO2短时降低
PaCO2短时增加(COPD)
支气管痉挛
少,高敏病人相对多
气胸
只发生在经支气管肺活检同时进行
支气管反应性
无变化
上皮完整性
支气管纤毛摆动短时降低,
但BAL进行24小时后,上皮细胞通透性无影响
出血
不明显
2.副反应的预防:
副反应随着灌注量及灌注肺段的增加而增加,仔细操作,特别注意能使并发症减少到最小程度。
●全面了解病史,进行肺功能试验,血气分析,血小板计数,出凝血时间,心电图,胸部放射片
●ECG,氧饱和度监测并予吸氧
●BAL后24小时观察
●限制灌洗量到最小需要量
●适当的操作前用药,必要时使用ß
-受体激动剂等
●特殊病人严格掌握适应征
3.BAL时副反应发生的危险因素
●>
50%的肺野渗出实变PaO2<
60mmHg
●SaO2<
90%,支气管反应性PC20<
2ug/ml乙酰甲胆碱
●FEV1<
60%预计值,或FEV1<
1LProthrombintime<
50%
●血小板计数低于20,000/ml明显异常的ECG
●对镇静剂敏感或不能耐受严重的伴发症
PC20:
FEV1降低20%所需的最低乙酰甲胆碱浓度
五.BAL操作
绝大多数在局麻下使用纤维支气管镜进行。
BAL总是在其它纤支镜操作之前,以免造成BAL的不纯。
1.操作前用药:
●镇静剂:
以便病人合作;
●胆硷能受体抑制剂:
减低迷走反射,支气管分泌,可增加BAL回吸收。
2.局部麻醉:
必须彻底,防止咳嗽,因咳嗽致损伤,出血及灌洗液丢失。
但进行BAL前应将利多卡因吸走以免影响细胞回收,活性及功能。
3.灌洗部位:
常规为右中叶,左舌叶。
中叶易于操作及嵌顿,回收的BAL较灌洗下叶多20%;
对于大多数弥漫性间质性肺病病人,一个部位灌洗应该能代表全肺并能提供足够的临床资料;
局部病变如肿瘤,炎性渗出等需行局部病变部位灌洗。
4.灌洗液:
无菌生理盐水,370C或室温。
5.灌注和回收方法:
20-50ml/次,总量100-300ml/肺段。
临床上较实用而安全的灌洗量:
5x20ml。
6.回收方法:
每次灌注后立刻经朔料注射器手动回抽或吸引器低压轻轻吸引(25-100mmHg);
通常回吸收40-70%,<
25%时,BAL不可靠;
回收的液体必须收集在朔料或硅化的注射器或容器内,防止巨噬细胞附着;
可借助于导管进行灌注,嵌顿后将导管从活检孔送至支气管镜尖端,再行灌注有利于注射器的变化,同时降低死腔。
7.BAL操作关键:
局麻充分;
防止病人咳嗽;
无急性支气管炎;
支气管镜嵌顿。
六.BAL液的实验室处理
1.细胞计数与活性
1)所有回收液经两层纱部过滤,移去粘液,充分混匀
(若使用20ml/次,因第一管回收的液体及细胞占总量比例很小,计入总量内,对结果影响不大)。
2)观测性状,测定液体量
如BAL液呈混浊奶白色,提示肺泡蛋白沉着症,需进行PAS染色,电镜检查。
如BAL液呈橘黄色,提示出血,需行铁染色。
3)离心1500rpmx10min
●上清液保存在-800C冰箱,以作生化成份分析。
至目前为止,尚无一个可靠的参考定量标准.故尚无法用于临床。
●细胞沉淀用2mlMBE充分混匀后,等分装在两个eppendorf管内,1管用作细胞分类计数,另1管用作细胞免疫分析。
*如果是血性BAL,需先进行梯度离心分离淋巴细胞,加1mlFicoll液于前述留作细胞免疫分析用的1ml细胞悬液的底部,梯度离心3000rpmx3min+2000rpmx5min,让离心机慢慢减速而停止.小心吸取细胞环,用MBE2ml悬浮,洗涤。
*如怀疑石棉肺:
则先混匀所有回收液(过滤离心前),从中取出10ml+30ml蒸馏水混匀,室温静置约一小时,破坏细胞,有利于被巨噬细胞吞噬的石棉小体释放。
轻轻摇晃,经石棉小体过滤装置(Millipore)真空过滤,过滤后,0.45um微孔膜空气干燥,注意避免打折
小心转移滤膜至圆形玻片上,用Histokitt封片
因用Histokitt封片后,亮度足够镜下观察,故没有必要用丙酮溶解滤膜。
光镜(10x或40x)下计数整张滤膜上的所有石棉小体.被过滤的BAL毫升数(如10)除,得结果:
石棉小体数/mlBAL
4)细胞总数与活性测定
●细胞总数:
10ul上述细胞混悬液+200mlTurck溶液,充分混匀,取适量填充于血细胞计数板内计数或采用自动计数仪计数。
血细胞计数板(Neubauercellchamber)数四角大方格(16x4个小方格)内细胞数,计算公式为:
细胞总数=细胞数x52.5(计数板溶积)x2000ul(含所有细胞)
106
=细胞数x0.105=?
(x106细胞)
●细胞活性:
50ul上述细胞混悬液+10ul台盼蓝(Typanblue)溶液,充分混匀,取适量填充于血细胞计数板内,5-10分钟内计数100个细胞内存活细胞的百分率%,死细胞染成蓝色。
通常于320倍放大下计数。
通常活性在80-95%,<
50%细胞活性,细胞形态及功能明显受影响。
2.细胞分类检查:
1)细胞涂片方法:
●常规手推片:
简单,能适用于大多数需要,尤其适应于要进行肿瘤细胞鉴定的BAL及血性BAL.将上述留作细胞学检查的细胞混悬液离心后进行涂片,空气干燥。
合格涂片细胞密度适当,细胞分布均匀。
●细胞离心涂片:
每张片5-20x104细胞。
细胞保存液,离心速度,时间均可影响细胞分类。
细胞离心涂片降低淋巴细胞分类。
当细胞总数<
1x106时,通常采用细胞离心涂片,当细胞总数<
1x106时,经验稀释法如下:
细胞总数(x106)
细胞悬液
+
MBE
0.5
0.6
500ul
250ul
0.7
400ul
300ul
0.8
350ul
0.9
1.0
450ul
将细胞充分混合后,每管200ul于细胞离心机离心650rpmx2min
●微孔过滤:
每张过滤纸200,000细胞,让其进行重力引流(gravitydraining)涂片。
保持样本湿化是关键,干燥将产生严重的细胞变性.适合于改良的Haematoxylin-eosin,Papanicolaou染色,后者较好地显示细胞核与细胞浆,有利于瘤细胞,病毒包含体的鉴别,与细胞离心涂片比较,淋巴细胞比例增加,嗜中性粒细胞比例降低
●点吸涂片:
将上述留作细胞学检查的细胞混悬液离心后,调节细胞数不要>
106细胞/ul进行点吸涂片,取一滴(约10ul)细胞液滴于玻片,即刻回吸,形成一细胞圈;
重复上述操作,做成四个细胞圈排列于玻片一端,空气干燥。
*每份BAL样本通常做3张涂片,一张做普通染色,另二张备做特殊染色。
当怀疑机会性肺部感染,需做抗酸染色,甲苯胺蓝染色时,应加做点吸涂片二张.
2)细胞染色:
●常规染色(供做细胞分类):
May-Grunwald-Giemsa(MGG)染色
●特殊染色:
Fe染色(Berlinbluestain)
PAS染色,过碘酸雪弗染色(PeriodicacidSchiff'
sstain)
甲苯胺蓝染色(Toluidinestain)
苏丹染色,脂肪染色(SudanIIIstain)
抗酸染色(Ziehl-Neelsenstainforacid-fastbacillistain)
3)细胞分类计数:
●MGG染色涂片于光学显微镜下观察,计数至少600个白细胞求分类百分比。
●半定量估计上皮细胞,红细胞,如上皮细胞>
5%提示支气管成份的混入。
●另外观察细胞形态,巨噬细胞内吞噬体,尘粒,石棉小体,红细胞片段,CMV包含体,卡氏肺囊虫(PCP),细菌,霉菌,异形上皮及肿瘤细胞。
3.免疫细胞学分析
●免疫细胞化学法,如过氧化酶抗过氧化酶反应
●免疫荧光或流式细胞仪分析(Immunofluorescenceorflowcytometry)
免疫荧光优点:
流式细胞仪自动测定,双标计有利于研究两种不同表面抗原的平行表达
免疫荧光缺点:
非参数计录,非细胞形态显示,巨噬细胞的自动荧光干扰
免疫化学方法优点:
光学显微镜,永久保存,形态学观察,敏感性高
免疫化学方法缺点:
虽双标记可能,但耗时间
4.过氧化酶抗过氧化酶方法(perioxidase-antiperioxidasemethod)
是进行BAL细胞免疫分析常使用的方法。
优点:
所需细胞少,20,000细胞/反应区,所需用抗体少
细胞形态保存好(因为避免了干燥,离心,丙酮固定,因此优于经空气干燥的细胞离心涂片所进行的免疫化学染色)
1)细胞的准备:
●将前述留作免疫细胞分析的细胞用MBE洗3次,离心1500rpmx3min
●再用MEM洗3次,离心1500rpmx3min
●稀释至适当的细胞浓度,一般10x106/ml,若巨噬细胞多,使用二倍MEM稀释,若淋巴细胞细胞多,使用1/2倍MEM稀释
2)细胞附着:
●吸附玻片用温水洗去绿色保护层,再用NKH溶液冲洗(注意不要损坏反应区带正电的薄膜,因其吸附带负电的细胞)。
●将混匀的细胞悬液10ul(20,000细胞)加于每个反应区,显微镜下监控细胞密度.如细胞层过厚,需进一步稀释,如太薄,需加更多细胞.细胞于湿合内室温下静置10分钟,防止细胞干燥。
3)细胞固定:
●真空吸去MEM,加10ul0.05%戊二醛于每个反应区,让其反应5分钟,吸走固定液,用NKH洗三次。
(固定有利于细胞形态保存,细胞附着,阻止细胞表面的Fc受体)。
4)加10ul准备好的MAG-Sweine于每反应区,震荡浮化15分钟,吸走MAG-Sweine。
(以避免免疫球蛋白连接于玻片表面)
5)加特异的单克隆抗体10ul,震荡浮化15分钟。
*到此,反应可以斩停,细胞片放于40C冰箱保存。
6)过氧化酶抗过氧化酶反应:
*用NKH喷雾清洗多于抗体,相继先后在三个盛有NKH的玻璃器皿内漂洗3次,仔细从侧边吸走过剩的NKH。
●加10ul准备好的RAM到每个反应区,于震荡器上震荡浮化5分钟,用NKH清洗玻片同上述。
●加10ul准备好的SAR溶液于反应区,于震荡器上震荡浮化5分钟,用NKH清洗玻片同上述。
●加10ul准备好的PAP溶液于每反应区,震荡浮化5分钟,同前用NKH清洗后,再让玻片留于第三瓶NKH内震荡清洗5分钟。
7)DAB反应:
●移去过度的NKH,加DAB10ul于每反应区,反应10分钟,用NKH喷雾洗去DAB,再将玻片放于新鲜的NKH溶液钟震荡清洗5分钟。
(注意:
DAB是致癌物,需保护性操作,一定要在排风装置下,戴口罩,手套操作,DAB废物特殊存放,特殊处理)
8)Osmium反应:
●移走多余的NKH,加10ulOsmium于每反应区,置于湿合内于冰上反应10分钟进行后固定,用蒸馏水清除过剩的Osmium,玻片短时置于蒸馏水的器皿中。
Osmium是有毒物,需保护性操作,一定要在排风装置下,戴口罩,手套操作,Osmium废物特殊存放,特殊处理)
9)封盖玻片:
●移走过量的蒸馏水,滴玻片覆盖液适量,加盖玻片,轻轻挤压移去多量覆盖液,不要留气泡,不要挤压细胞,清洗表面,轻轻试干,用无色指甲油封片。
10)光学显微镜下计数至少200个淋巴细胞或巨噬细胞(包括阳性和阴性细胞),求出阳性反应细胞的百分率。
5.细胞染色方法
1)May-Grunwald-Giemsa(MGG)染色:
●空气中凉干的细胞涂片于浓缩的May-Grunwald溶液中染色3-5分钟
●蒸馏水短时冲洗
●1:
100Giemsa蒸馏水混合液中染色15分钟
●自来水短时冲洗,空气中凉干,加Histokitt封片
2)Fe染色(Berlinblue染色):
注意:
禁止使用含Fe的镊子和容器
●空气中凉干的细胞涂片于纯甲醇(methanol)中固定5分钟
●配制PotassiumHexacyanoferrateII溶液:
1gPotassiumhexacyanoferrateII3H2O
+100ml蒸馏水
+1ml37%HCL
(盐酸加入使之易氧化,由无色清亮变为绿色,特殊废品处理)
●玻片于新鲜的PotassiumHexacyanoferrateII溶液中作用8分钟
●于Mayer氏苏木精明矾(Mayer'
shaemalaun)染液中染色2-5分钟(染核)
●蒸馏水中清洗最多10分钟显蓝色
●空气干燥,滴玻片覆盖液如Histokitt,加盖玻片。
3)甲苯胺蓝(Toluidineblue)染色:
●点吸细胞涂片空气干燥至少半小时
●准备醋酸硫酸混合液:
30ml浓醋酸(concentratedaceticacid)
+10ml浓硫酸(concentratedsulphicacid)
使用前冷却10分钟
●细胞涂片放于准备好的醋酸硫酸混合液中浮化5分钟,轻轻摇晃至少3次,以促进细胞更好溶解。
●自来水流动清洗5分钟
●甲苯胺蓝瓶中封盖染色5分钟
●自来水流动清洗3分钟
●玻片先后在96%和100%乙醇(ethanol)中浸蘸约10秒
●空气干燥,滴玻片覆盖液如Histokitt,加盖玻片
PAS染色
●涂片空气干燥至少2小时
●蒸馏水短暂冲洗
●玻片于过碘酸(periodicacid)溶液中浸泡5分钟
●放玻片于Schiff'
s试剂中10分钟
●放玻片于SO2水中5分钟
●Mayer'
shaemalaun染液中30秒对照染色
●自来水中清洗5分钟至显蓝色
●玻片先后于96%和100%乙醇各5秒钟脱水
●空气中凉干,加Histokitt封片
SO2水配制:
0.6gNa-disulphite
+100ml自来水
+5ml1NHCL
4)SudanIII染色(脂肪染色)
●细胞涂片空气干燥至少半小时
●蒸馏水中短暂浸蘸,50%乙醇(ethanol)中固定5分钟
●SudanIII溶液中封盖染色30分钟
●50%乙醇(ethanol)中固定10秒,蒸馏水短暂冲洗
shaemalaun染液中5分钟对照染色
●蒸馏水中清洗5分钟至显蓝色,空气中凉干,加Histokitt封片
5)抗酸染色:
●手推细胞涂片或点吸涂片空气中干燥至少半小时,加热固定
●玻片用浓缩的石炭酸品红液(carbolfuchsin)覆盖,加热蒸发过多染料至少5分钟
●自来水冲洗,玻片用盐酸酒精(HCL-alcohol)彻底脱色
●用自来水冲洗,美蓝(Methyleneblue)对照染色至多45秒
●自来水冲洗,空气中凉干,加Histokitt封片
6)肥大细胞染色:
●细胞涂片空气中干燥至少1小时,10分钟固定
●固定液组成:
50ml纯酒精(100%ethanol)
+40ml氯仿(chloroform)
+10ml醋酸(aceticacid)
●自来水流动冲洗5分钟
●甲苯胺蓝(Toluidineblue)溶液中染色20分钟
●在96%乙醇(ethanol)中浸蘸2次,空气中凉干,加Histokitt封片
6.试剂配制
1)正常人血清(ABserum)分离
非抗凝血于560C浮育30分钟
40C冰箱静置2小时,离心5000rpmx20min
分离的血清按200ul分装,置于-200C冰冻保存
2)兔抗鼠免疫球蛋白原液(rabbitanti-mouse,RAMstocksolution)1:
50
50ul兔抗鼠免疫球蛋白(RAM)
+200ul正常人血清(ABserum)
+200ul猪血清(swineserum)
+2500ulMAG
40C冰箱储存可用二周
3)猪抗兔免疫球蛋白(swineanti-rabbit,SAR)
50ul猪抗兔免疫球蛋白(SAR)
+100ul人血清(ABserum)
40C冰箱孵化至少一天后待用,可存放4周
4)DAB(排风装置下,戴口罩,手套操作)
0.5gDAB
+50mlNKH(无Hepes,无酚红)
+5mlHepes(pH8.0)
+2ml明胶(gelantine)370C加热溶化
混合后,按2ml分装,置于-200C保存
DAB使用液:
2mlDAB+20ul3%H2O2
DAB-PAP探针试验:
5ulPAP+50ulDAB反应显棕色,40C冰箱保存可使用二天。
5)Osmium(排风装置下,戴口罩,手套操作)
250mgOsmium
+100mlSorensen-PBS(0.1M/L,pH7.4)
避光封装,40C冰箱保存
6)Latex
1000ulMEM(应用液)+50ul22%BSA+5ulLatex
溶液于370C水浴预热15分钟
7)BAL细胞转送液
50mlMEM(应用液)+2.5ml22%BSA
8)抗体
各种冻干抗体按说明溶解
分装:
20ul抗体液+10ul液体石蜡,-200C冰冻保存
应用时,抗体室温解冻后,用MAG进行稀释,稀释倍数因抗体而异,如1:
50或1:
100
9)盐酸酒精溶液(HCL-alcohol)
270ml蒸馏水+700ml酒精+30ml37%HCL
10)过碘酸溶液(Periodicacidsolution)
3.75g过碘酸(H5IO6)+500ml蒸馏水
11)甲苯胺蓝(Toluidineblue)溶液
0.15g甲苯胺蓝0(Toluidineblue0)
+30ml蒸馏水
+70ml纯乙醇(100%ethanol)
+1ml37%HCL
12)SudanIII溶液
1gSudanIII+100ml70%乙醇(ethanol)
于350C水浴震荡溶解,冷却后过滤,避光保存
13)MAG(M=MEM,A=Albumin,G=Gelatine)
50ml浓缩MEM
+2mlHepes(pH8.0)
+500ul22%BSA(牛血清白蛋白)
+2ml5%Gelatine(明胶)(需水浴溶化)
+500ul10%NaN3(叠氮钠)(有害物,注意保护性操作)
配制好的MAG于40C冰箱保存可用一周左右
14)5%EDTA
5gTitriplexIII先用70-80mlNKH(无Hepes,无酚红,pH4-5)溶解,用NaOH调节pH为7.4,用同上NKH配成100ml.40C冰箱保存可达4-8周。
15)05%戊二醛(glutaraldehyde)
200ul25%戊二醛(有毒性)
+100mlSoerensenPBS(pH7.8)
+2.5ml40%葡萄糖
40C冰箱保存
16)5%明胶(Gelatine)
5g明胶先用80ml蒸馏水于500C溶解,加1mlNaN3,用1NNaOH调节pH至7.4,用蒸馏水配成100ml,按2ml分装,40C冰箱保存
17)1M/LSoerensen磷酸缓冲液,SoerensenPBS(Soerensenphosphatebuffer)
3.4gKH2PO4+250ml蒸馏水
7.7gNa2HPO4+500ml蒸馏水
加磷酸二氢甲溶液(0.1M/L)到磷酸氢二钠溶液至所需要的pH值
(如pH7.8,加约87ml)
*pH7.4为配制Osmium和玻片覆盖液准备
*pH7.8为配制戊二醛准备
分装,-200C冰冻保存
18)Hepes缓冲液1M/L
23.83gHepes先用80ml蒸馏水溶解
用1M/LNaOH调节pH至7.4或8.0,用蒸馏水配成100ml
* HepespH7.4为配制NKH溶液准备,HepespH8.0为配制MEM使用液准备
19)免疫细胞片覆盖液(coversolution)
80ml甘油(Glycerin)
+15mlSoerensenPBS(0.1M/L,pH7.4)
+5ml25%戊二醛(glutaraldehyde)(毒性,排风装置下操作)
20)需每天新鲜配制的应用液
a)MEM(miniumessentialmedium)应用液
5ml浓缩MEM
2mlHepes(pH8.0)
加蒸馏水配制成50ml
b)MBE(M=MEM,B=BSA,E=EDTA)
30mlMEM应用液
250ul22%BSA(牛血清白蛋白)
600ul5%EDTA
c)NKH(N=Natriumchlorid,K=Kaliumchlorid,H=Hepes)
8gNaCL + 0.4gKCL
+ 1L蒸
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