山楂的降血脂有效部位提取工艺研究Word格式.docx

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（1）降血脂作用：

众所周知，减少血脂对山区的影响，大量动物实验和临床观察表明，单独和复合山药可以大大减少严重胆固醇和甘油，有效预防运动性关节炎。

其中熊果酸是山中三种真菌类的一种成分，是调节血脂和预防动脉粥样硬化的有效成分。

（2）降压作用：

山地乙醇灌注提供静脉药物，可以减缓麻醉兔血压的下降并保持血压。

山楂总孕激素的静脉注射治疗可以降低猫的血压并保持血压。

他的全部提现很少老鼠、兔子和猫也有更明显的中枢减压效果。

北山种植孕酮、三色酸和水解、围产期注射和十二指肠药物，显示出不同程度的降压作用对麻醉猫血压的影响。

山楂酸在一个范围内，降压效果随着冥想最强，剂量的增加也不会相应增加。

如果将山区孕酮与相同剂量的三磷酸蘑菇水解相比较，三酸蘑菇的减压效果最为明显，但产生显着减压效果的剂量最低。

它的减压机制是建立在周边血管扩张的基础上的。

提交人将山楂糖浆用于每一种等同于原药的药物，每种药物都是一个月为高血压患者提供一次有效的治疗，这对冠心病等心血管疾病的防治显然是有益的。

（4）抗心率失常作用：

山楂浸膏对垂体后叶素引起的心率不齐，有一定的抑制作用。

2.3.2三萜酸类的药理作用

多数的研究表明山楂黄酮类成分具有降压、增加冠脉血流量、降血脂、强心和抗心律失常的药理作用。

2.3.3助消化作用

山楂中脂肪酸可促进脂肪分解，山楂酸等可提高蛋白分解酶的活性，有助消化[18]。

2.3.4抗癌作用

河南医科大学药理室以大鼠实验表明，山楂提取物对人胚肺2BS细胞及诱癌细胞的抑制作用。

这些显示山楂有抗癌作用[2]。

3.山楂总黄酮类研究

3.1总黄酮的提取分离

其中常用的提取方法概述如下：

（1）水煮浸提法：

流程为：

山楂叶→水浸煮（2次）→滤液浓缩→沉淀→过滤→干燥。

（2）溶剂萃取法：

山楂叶→用70%乙醇提取→减压回收乙醇→水分散→用正丁醇萃取→回收正丁醇→总黄酮。

（3）聚酰胺分离法：

山楂叶→用70%乙醇提取→回收乙醇→加入聚酰胺粉→用乙醇梯度洗脱→收集各级洗脱液→合并浓缩。

（4）树脂吸附法：

山楂叶→浸渍→回收乙醇→过滤→树脂分离→回收乙醇→干燥

3.2单成分的分离

山楂叶乙醇提取物经聚酰胺柱层析分离即可得到牡荆素[13]。

其中丙酮提取物经硅胶柱层析，氯仿—甲醇—水梯度洗脱，薄层层析检控，相同部分合并，分别得到槲皮素、金丝桃苷、牡荆素、牡荆素鼠李糖苷、盐酸二乙胺等化合物。

3.3成分的测定

研究人员利用高效液相色谱和薄层色谱测定山楂叶黄酮。

而且利用此法检测出山楂叶中含有少量的如斯多苷。

4.有效部位的提取精制工艺研究

4.1山楂叶中总黄酮的提取精制工艺研究

科学合理选择中药的提取工艺是保证疗效的关键和核心，也是中药现代化的前提和基础。

4.1.1试验仪器和药品

山楂叶系蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br的干燥叶，采收自河北兴隆县；

大孔树脂，购自北京化学试剂公司；

乙醇等，分析纯

4.1.2山楂叶药材中总黄酮含量的测定

药材供试品溶液的制备：

精密称取粉碎为100目的药材细粉0.5g，加入40mL的60％乙醇，60℃水浴30min，时常振摇，滤过，同法提取3次，合并滤液，水浴挥干，加入10mL60％乙醇溶解，加入0.3g聚酰胺粉，搅匀，转移至装有0.3g聚酰胺的小柱中，用100mL乙醇分次洗脱，收集洗脱液，置水浴上浓缩至干，使用60％乙醇溶解转移至50mL容量瓶中，定容，作为供试品溶液。

其它同2.2山楂叶黄酮提取部位的含量测定方法，进行药材中所含总黄酮的测定。

4.1.3山楂叶总黄酮提取精制工艺的初步选择

本文选定乙醇提取大孔树脂精制的方法，保证了黄酮有效部位的含量，减少了有机溶剂的污染，并在此基础上进一步开展了工艺优选研究。

4.1.4山楂总黄酮乙醇提取工艺影响因素的考察

（1）乙醇浓度对山楂总黄酮提取率的影响

精密称取山楂叶粗粉（20目）25g共4份，分别加0，30，60，95％乙醇500mL，浸泡1h，回流加热1.5h，滤过，残渣用少量溶媒洗涤，合并滤液，减压干燥，得粗粉。

按上述总黄酮测定方法操作，测定山楂总黄酮含量，与药材中含有量相比，按公式（3－1），计算提取率，结果见表3－1。

（3-1）

表3-1乙醇浓度对山楂总黄酮提取率的影响

乙醇浓度（%）

30

60

95

提取率（%）

25.1

49.9

73.2

63.1

（2）提取时间对山楂总黄酮提取率的影响

精密称取山楂叶粗粉（20目）25g共5份，分别加入60％乙醇500mL，浸泡1h，回流加热5，20，30，40，60min，滤过，残渣用少量溶媒洗涤，合并滤液，减压干燥，得粗粉。

按上述总黄酮测定方法操作，测定山楂总黄酮含量，与药材中含有量相比，按公式（3－1），计算提取率，结果见表3－2。

表3－2提取时间对山楂总黄酮提取率的影响

时间（min）

5

20

40

5.1

48.6

61.9

63.9

71.4

（3）溶剂用量对山楂总黄酮提取率的影响

精密称取山楂叶粗粉（20目）25g4份，分别加入60％乙醇125，250，375，500mL，浸泡1h，回流加热60min，滤过，残渣用少量溶媒洗涤，合并滤液，减压干燥，得粗粉。

按上述总黄酮测定方法操作，测定山楂总黄酮含量，与药材中含有量相比，按公式（3－1），计算提取率，结果见表3－3。

表3-3溶剂用量对山楂总黄酮提取率的影响

溶剂用量（mL）

125

250

375

500

33.4

50.2

56.9

72.9

（4）提取温度对山楂总黄酮提取率的影响

精密称取山楂叶粗粉（20目）25g4份，分别加入60％乙醇500mL，浸泡1h，分别在40、60、80、100℃水浴中加热回流90min，滤过，残渣用少量溶媒洗涤，合并滤液，减压干燥，得粗粉。

按上述总黄酮测定方法操作，测定山楂总黄酮含量，与药材中含有量相比，按公式（3－1），计算提取率，结果见表3－4。

表3-4提取温度对山楂总黄酮提取率的影响

温度

80

10

33.1

63.0

69.1

74.9

4.1.5树脂吸附性能的考察

（1）树脂的预处理

大孔吸附树脂（40～60目）置索氏提取器中用乙醇加热提取48h，装柱。

用乙醇洗至254nm波长下检测吸收度为零，真空干燥。

使用前用乙醇浸泡12h，再用蒸馏水洗至无醇味，备用。

（2）装柱

将玻璃柱底部铺一层脱脂棉，湿法装入一定量预处理过的树脂，待树脂沉降后，在上面铺一层脱脂棉，加入0.2g中性氧化铝，再铺一薄层脱脂棉，用蒸馏水浸泡，备用。

（3）不同型号D101型大孔吸附树脂吸附率和解吸率的比较

精密称取各种干树脂1.0g，置具塞锥形瓶中，加入山楂叶提取物（山楂总黄酮含量为72.4％）溶液200mL，放入恒温（30℃）水浴中，经常振摇18h，充分吸附后，滤过。

测定溶液中剩余山楂总黄酮含量，按公式（3-2）计算：

公式（3-2）

将吸附平衡后的树脂转移至内径9mm的玻璃柱中，用70％的乙醇解析，测定解吸液中总黄酮含量。

按公式（3-2）计算解析百分率，结果见表3－5。

公式（3-3）

表3－5不同型号大孔树脂的吸附量和解吸率

型号

D-101

D-101A

D-101C

吸附量（mg/g）

256.5

231.2

280.2

解吸率（%）

95.3

97.9

93.9

由表3－5可知，三种大孔吸附树脂的吸附量和解吸率都较高，其中D-101C型吸附量较大，而D-101A型解吸率较高。

（4）浓度对吸附的影响（吸附等温线）

精密称取0.5g干树脂，处理后放入具塞锥形瓶中，加入40mL不同浓度的山楂总黄酮样品水溶液，密塞，置恒温（30℃）水浴中，经常振摇24h，过滤，取续滤液0.8mL，在表面皿上水浴蒸去溶剂，按山楂总黄酮含量测定方法测定含量。

按公式（3-3）计算吸附量。

以平衡浓度为横坐标，吸附量为纵坐标，得到吸附等温线，见图3－1。

图3－1浓度对吸附的影响

由图3－1可知，随着平衡浓度的增大，树脂的吸附量增大，逐步趋于最大值，符合Brunauer的第一类吸附等温线。

溶液的浓度与吸附量的关系可用公式（3－4）表示：

（3－4）

其中：

q为吸附量（mg/g）；

b为吸附平衡常数；

q为饱和吸附量（mg/g）；

C为山楂总黄酮的平衡浓度。

上式可改成：

（3－5）

以

作图，可得一直线，由直线的斜率可得饱和吸附量

为687mg/g。

（5）温度对吸附的影响

精密称取0.5g干树脂5份，处理后放入具塞锥形瓶中，各加入40mL浓度为5mg/mL的山楂总黄酮水溶液，分别于25，35，45，55，65℃水浴中放置24h，定时摇动，其余同上法操作，按山楂总黄酮含量测定方法测定含量。

按公式（3－3）计算吸附量。

结果见图3－2。

图3-2温度对吸附的影响

（6）温度对吸附的影响

精密称取干树脂0.5g10份，处理后放入具塞锥形瓶中，分别加入5mg/mL的山楂总黄酮水溶液40mL，再加入NaCl或KCl调至盐离子浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mol/L，密塞，放入恒温（30℃）水浴中，经常振摇24h，充分吸附后，滤过。

其余操作同1.6.4。

结果见图3－3。

由于盐离子的存在，使树脂对山楂总黄酮的吸附量有所增大。

图3-3温度对吸附的影响

（7）山楂总黄酮的吸附曲线

精密称取干树脂1.0g，处理后装柱，以6BV/h的速度将2mg/mL的山楂总黄酮水溶液通过树脂柱，每5mL收集一次流出液，以流出液的体积与流出液中山楂总黄酮的浓度作图，结果见图3－4。

图3-4山楂总黄酮的吸附曲线

（8）洗脱液的考察

取0.5g处理过的树脂装柱，加入5mg/mL的山楂总黄酮水溶液0.8mL，用20mL水洗去杂质，分别用30％、50％、70％、95％乙醇洗脱，作图3－5。

图3-5洗脱液的考察

（9）洗脱剂流速的考察

取0.5g处理过的树脂装柱，加入5mg/mL的山楂总黄酮水溶液0.8mL，用20mL水洗去杂质，乙醇为洗脱剂，分别以7，14，21，35BV/h的流速洗脱，以洗脱液的体积为横坐标，洗脱液的浓度为纵坐标作图3－6。

图3-6洗脱剂流速的考察

（10）大孔吸附树脂吸附纯化山楂总黄酮的工艺

经过上述试验，将大孔吸附树脂的纯化工艺确定为，取1.0g处理过的树脂装柱，加入每1mL相当于1g药材的山楂总黄酮水溶液10mL，将上述水溶液以6BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，用12BV的水以14BV/h的流速洗去杂质，最后用15BV70％乙醇用同一流速洗脱。

4.1.6工艺的验证

精密称取500g山楂叶粗粉，用乙醇浸泡1h，加热至70℃，滤过，滤渣再加入乙醇提取40min，合并过滤液，减压浓缩，浓缩至无乙醇，制成每1mL相当于药材1g的流浸膏，将上述水溶液以6BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，用12BV的水以14BV/h的流速洗去杂质，最后用15BV70％乙醇用同一流速洗脱。

洗脱液真空干燥。

重复三次，总黄酮含量达到65％以上。

4.1.7讨论

结合文献资料，详细考察了乙醇用量、乙醇浓度、加热时间、提取温度对山楂总黄酮提取率的影响，采用均匀设计对提取工艺进行优化，选择乙醇浓度为60％。

4.2山楂果中总三萜酸部位提取工艺的研究

本文结合三萜酸类的性质使用乙醇提取－酸碱处理的方法提取精制山楂三萜酸类有效部位，提取物的纯度可达到50％以上。

4.2.1提取工艺优选

（1）醇提取条件的确定

在乙醇提取过程中影响因素主要有乙醇的浓度、提取时间、提取溶媒的用量等。

并确定使用正交实验法优选提取工艺条件，因素水平见表3－9。

乙醇浓度（％）

提取时间（h）

乙醇用量（倍）

1

4

15

2

70

6

3

8

25

表3-9醇提取条件的确定

实验方法为，精密称取山楂饮片50g，加入设定浓度乙醇回流提取设定时间。

乙醇总用量为设定倍量。

提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至比重。

量取适量稠膏真空干燥，精密称定，按含量测定方法测定总三萜酸含量，按公式计算提取率作为指标。

见表3－10。

表3－10总三萜酸含量

序号

A

B

C

D

结果

2.65

2.58

1.71

2.08

2.80

2.44

7

2.61

1.62

9

2.16

Ⅰ

6.94

7.34

6.71

7.61

Ⅱ

7.32

7.00

6.82

7.63

Ⅲ

6.39

6.31

7.12

5.41

R

0.31

0.34

0.14

0.74

平方和

142.58

142.69

142.23

145.40

s

0.1458

0.1836

0.0300

1.0854

表11

变差来源

离差平方和

自由度

均方

F值

P值

0.0729

4.855

p<

0.01

0.0918

6.116

0.01501

0.5427

36.154

误差

0.0150

总和

1.4448

0.7224

（1）总三萜酸含量

确定硫酸溶液的最适浓度。

工艺为：

精密称取山楂饮片200g，加入乙醇回流提取两次，每次2小时。

乙醇用量为8倍、7倍。

提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至比重。

以上稠膏平均分3份，加入浓缩膏体积2倍量的硫酸溶液，加热保温2小时，过滤，水洗2次，用NaOH溶液洗涤2次，最后用适量水冲洗，真空干燥，即得总三萜酸提取物，见表3－12。

表3-12总三萜酸含量

编号

硫酸浓度（％）

收率（％）

总三萜酸含量（％）

三萜酸量提取率（%）

8.1

34

2.754

6.6

48

3.168

4.3

57

2.451

（2）碱浓度的确定

确定碱液洗涤的最适浓度。

精密称取山楂饮片200g，加入乙醇回流提取两次。

稠膏平均3份，加入浓缩膏体积2倍量硫酸溶液，加热保温2小时，过滤，水洗2次，再分别用NaOH溶液洗涤2次，最后用适量水冲洗，真空干燥，即得总三萜酸提取物。

见表3－13。

表3-13碱浓度的确定

碱液浓度（％）

5.4

46

2.484

4.5

58

3.9

59

2.301

4.2.2提取工艺的验证

精密称取山楂饮片50g，加入提取两次，每次2小时。

提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至比，浓缩膏加入2倍量硫酸溶液，加热保温2小时，过滤，水洗2次，再用NaOH溶液洗涤2次，最后用适量水冲洗，真空干燥，即得三萜酸部分。

见表3－14。

表3-14提取工艺的验证

批次

熊果酸含量（％）

4.6

2.622

7.15

7.09

4.8

54

2.592

7.21

4.2.3讨论

结合文献资料，详细考察了乙醇浓度、提取时间、乙醇用量等因素对山楂三萜酸提取率的影响，采用正交设计对提取工艺进行优化，该法具有提取率高、成本低、无有机溶剂污染等的优点。

4.3本章结论

通过以上试验确定了山楂叶中黄酮类的提取精制工艺和山楂果中三萜酸类的提取精制工艺。

具体工艺如下：

1.精密称取500g山楂叶粗粉（20目），先用60％乙醇11.5L浸泡1h，加热至70℃提取40min，滤过，滤渣再加入11.5L60%乙醇提取40min，合并过滤液，减压浓缩，浓缩至无乙醇，加入一定量的水溶液，制成每1mL相当于药材1g的流浸膏，将上述水溶液以6BV/h的流速通过大孔吸附树脂柱，用12BV的水以14BV/h的流速洗去杂质，最后用15BV70％乙醇用同一流速洗脱。

洗脱液真空干燥，得黄褐色粉末，即得总黄酮提取部位。

2.精密称取山楂饮片50g，加入70％乙醇回流提取两次，每次2小时。

提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至比重为1.1g/mL。

浓缩膏加入2倍量6％硫酸溶液，加热保温90℃2小时，过滤，30mL水洗2次，再用3％NaOH溶液洗涤2次，每次30mL，最后用适量水冲洗，真空干燥，即得总三萜酸提取部位。

5.结论与展望

5.1结论

对山楂中降血脂有效成分黄酮类和三萜酸类进行了提取工艺、指标性成分测定、制剂处方前、制剂工艺等多方面的研究。

结论如下：

1采用乙醇提取－大孔树脂精制的方法提取山楂叶中的总黄酮。

2确定工艺为：

精密称取500g山楂叶粗粉（20目），先用60％乙醇11.5L浸泡1h，加热至70℃提取40min，滤过，滤渣再加入11.5mL60%乙