网格蛋白重链对TNF诱导的炎症信号转导是必需的Word文件下载.docx

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CHCsil降低了91%的p-IΚBα（P＜.03）;

但是IΚBα的降解并没有受到影响。

CHC敲除造成了TNF-α处理3分钟后66%的P65磷酸化的下降。

相比对照，CHCsil会使TNF-α诱导的MCP-1量下降46%（P＜.05）.

讨论.

CHCsil会严重降低IΚBα和P65的磷酸化水平。

CHCsil也会严重降低MCP-1的量。

这些数据表明CHC对某些TNF-α介导的炎症性信号通路是必需的。

（Surgery2006:

140:

268-72）

FromtheUniversityofColoradoHealthSciencesCenterandtheDenverHealthMedicalCenter

内吞作用是细胞吸收胞外分子并把它们分配到不同细胞区室进行加工，识别并循环利用的过程。

1然而，最新的证据显示，内吞作用也能辅助形成信号转导支架，这种支架能在受体附近聚集关键蛋白，辅助或决定它们的功能。

2网格蛋白介导的内吞作用（CME）对于许多受体的功能是必需的例如β-2肾上腺素能受体，3内皮素受体，4低密度脂蛋白吸收，5转铁蛋白吸收，6和许多其它G-偶联蛋白受体。

7CME的三个主要组成部分包括网格蛋白重链和轻链，来形成支架，衔接蛋白，用于连接并引导受体到网格蛋白，裂解蛋白以完成内化并将内体转运到其目的地。

8Huang等9证实，作为内吞作用的组成部分，网格蛋白重链的消除会导致内吞作用很大程度的降低。

肿瘤坏死因子α（TNF）启动并促进许多炎症反应，这些反应与外科，10烧伤，11败血症，12急性呼吸窘迫综合症，13和休克10,14有关。

其受体（肿瘤坏死因子受体1）的激活会启动并引发炎症性信号转导级联反应，最终导致抑制蛋白kappaB（IΚB）的磷酸化和降解。

这一结果使得转录因子核因子kappaB（NFKB）被磷酸化进而启动与炎症有关的基因表达。

15

单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）是NFKB驱动的炎症反应中间物，它由Ⅱ型肺细胞分泌。

MCP-1在炎症反应中辅助招募单核细胞到达肺部，并由TNF刺激来诱导。

15,16TNF由CME内化，但在TNF介导的信号转导中CME所起的作用还是未知的。

17CME的抑制会减弱TNF介导的细胞凋亡通路，受体上特定的内化结构域已被识别。

因此，我们研究了网格蛋白重链在TNF介导的炎症性信号通路中所起的作用。

我们假设CME的干扰会削弱TNF介导的信号转导。

方法

细胞培养和小分子干扰RNA转染。

人肺部上皮细胞（A549）培养在F12培养基（Mediatech,Herndon,Va）,添加10%胎牛血清（Mediatech）,100IE/mlpenicillin,和0.1mg/mlstreptomycin，37℃，5%CO2培养条件下直到达到60%到70%的汇合度。

这些细胞以50nmol/LCHC和非编码（或乱码）或TRADD双链小分子干扰RNA（siRNA）（Dharmacon,Inc,Lafayette,Colo）过夜处理,这几种物质与是先用非添加的F12溶液处理的脂质体2000（InvitrogenLifeTechnologies,SanDiego,Calif）。

为了获得最大的转染效率并敲除目的蛋白，我们在第二天重新转染细胞。

这次转染之后，在收细胞之前有一个24小时的成熟期使蛋白质得以周转。

在10ng/mlTNF-α（Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo）处理之前,培养基被重新换为胎牛血清添加的F12.

细胞收集和裂解。

TNF4小时处理后的细胞培养物上清收集用于细胞因子分析并以未用TNF处理的细胞作对照。

培养物放置在冰上并用冰预冷的磷酸盐缓冲液/磷酸酶抑制物混合物（ActiveMotifInc,Carlsbad,Calif）洗涤。

这一步之后是向孔中添加煮沸的含3%SDS-PAGE,1nmol/LDTT，和5×

Halt磷酸酶抑制物混合物的溶解液（PierceBiotechnologyInc,RockfordIll）。

孔中物用橡皮淀帚刮下后，用微型离心机收集，迅速置于100℃下加热10分钟，漩涡混匀。

非立即用的溶解产物储存在-70℃条件下。

免疫印迹。

细胞溶解产物的蛋白浓度（凝胶上样控制）由BCA蛋白质定量法（PierceBiotechnology,Inc）确定。

相同的蛋白质量上样到4%到15%的丙烯酰胺凝胶中，用SDS-PAGE分开，然后转移到硝酸纤维素膜上（Bio-RadLaboratories,Hercules,Calif）。

转移后的膜用5%的脱脂牛奶封闭1小时，用抗体进行免疫杂交。

抗磷酸化的IΚBα（Ser32）和磷酸化的P65（Ser536）的抗体从CellSignalingTechnology（Danvers,Mass）获得;

抗IΚBα（C-21），肌动蛋白（H-300）和网格蛋白重链（N-19）的抗体从SantaCruzBiotechnology,Inc（SantaCruz,Calif）获得。

抗小鼠和抗兔的辣根过氧化物酶偶联的二抗从JacksonImmunologicals（WestGrove,Pa）购买。

结合的抗体用增强型化学发光（ECL）免疫印迹检测系统（PierceBiotechnology,Inc）检测。

上样样品蛋白量根据条带亮度确定（ImageJsoftwareprogram;

NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md;

www.nih.gov）,用肌动蛋白的条带亮度校正，结果用对照（无siRNA处理）的条带亮度对比。

酶联免疫吸附试验。

在含有或不含有10ng/mlTNF4-小时孵育的细胞培养物上清中用酶联免疫吸附试验（ELISA）（ELISATech,DenverColo）检测单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的表达水平。

数据分析。

所有结果的数据分析选择方差分析或配对t检验。

P小于0.05，统计显著性是可以接受的。

结果

网格蛋白重链（CHC）siRNA处理的细胞相比于对照细胞会导致CHC91%的下降（P＜0.001，n=5）.非编码siRNA（Scram）不会造成CHC与对照相比的明显敲除（Fig1）.

之后我们分别评估了在不同时间点，TNF对于对照组，CHCsiRNA处理和乱码siRNA处理的IΚBα磷酸化的影响。

TNF处理细胞后，IΚBα磷酸化在5分钟达到最大化（Fig2），但在CHCsiRNA处理的细胞中却是减弱的。

为了消除CHCsiRNA的非特异性影响，我们比较了TNF诱导5分钟的CHC,TRADD和乱码siRNA（分别用作阳性和阴性siRNA对照）处理的细胞中总IΚBα和磷酸化的IΚBα量（Fig3）。

CHC敲除后，IΚBα磷酸化水平会显著降低（91%的降低，P＜.03，n=5），但是乱码siRNA处理的细胞没有IΚBα磷酸化水平的统计学的改变。

TRADDsiRNA在5分钟时会阻止磷酸化IΚBα的产生，但在10分钟时会产生一个小的峰（根据需要可获得数据）。

用磷酸化的P65（phos-P65）作为NFKB被激活的指示剂，我们比较了CHCsiRNA处理与非处理的细胞中TNF诱导的P65的磷酸化水平。

CHC-sil处理的细胞相比对照的细胞phos-P65有66%的下降（P＜.05，n=3；

Fig4）。

TNF处理4小时之后，上清的ELISA分析显示CHC敲除的细胞相比于对照的细胞MCP-1的产生量（P＜.001，n=5）有46%的下降（Fig5）。

讨论

越来越多的证据显示，许多受体依赖于网格蛋白介导的内吞作用进行最佳的信号转导。

网格蛋白重链的siRNA敲除显示出了对内吞作用最大的影响。

9通过减少CHC并评估其对TNF诱导的炎症性信号通路的影响，我们已经证明CHC对于肺部上皮细胞中完整的信号通路非常重要。

进一步的研究来说明网格蛋白在TNF诱导的信号通路的最佳支架的形成中所起的确切的作用是必要的。

多年以来，阐明一个敲除会致死的蛋白的功能几乎是不可能的。

利用非特异性的抑制物来抑制内吞作用并削弱TNF的诱导已经取得了一些成功。

19但是这些抑制物的化学特性可能会对细胞功能有其它影响，CME在TNF-α诱导的炎症性信号通路中所起的具体作用还不能确定。

双链RNA的沉默通过诱导能够在蛋白质翻译之前破坏目的蛋白mRNA的RNA诱导的沉默复合体的产生来降低目的蛋白的产生量。

20但是使用双链RNA也会有使其它蛋白质沉默的局限性。

为了降低这种影响，我们使用的是少于22个核苷酸的小分子的干扰RNA（siRNA）来减少目的蛋白的从头合成。

21我们同时使用阳性的（TRADDsiRNA）和阴性的（乱码的siRNA）对照来消除siRNA和转染试剂可能造成的偶然误差。

我们结果的其他局限性包括在兴奋剂诱导的炎症反应中的变化，这在不同的细胞系中已有报道。

有证据显示TNF在不同的细胞类型中可能会诱导不同基因的表达。

22同样地，一些改造的人类内皮和纤维肉瘤细胞系也被发现能够通过小窝蛋白或脂筏的途径而不是网格蛋白来内化肿瘤坏死因子受体1。

23,24我们目前正在进一步研究其它细胞类型，CME的其它组份，和炎症信号通路中的其它组份来进一步确定CME和网格蛋白在TNF诱导的信号通路中所起的作用。

我们的结果显示，人类肺部上皮细胞中CHC的敲除，会通过IΚBα磷酸化水平和NFKB磷酸化水平的下降来降低MCP-1的水平。

因此，我们得出结论，在这些细胞中，TNF受体需要借助网格蛋白重链来进行炎症性信号转导，导致如图6中MCP-1的产生。

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