蛋白质与挥发性风味成分的作用原理要素及研究方法综述生物化学论文生物学论文Word文档格式.docx

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　　氨基酸侧链结构的多样性使蛋白质与挥发性风味成分具有多种作用力，其部分为可逆结合，包括离子键，氢键以及疏水相互作用[6];

两者之间的共价键作用为不可逆结合，主要包括醛与赖氨酸残基侧链的氨基，胺类与羧基[7],及含硫化合物与蛋白质的结合[8].利用可逆结合可以降低加工过程的风味损失并使风味成分在食用时重新释放[9],而不可逆结合对于去除食品中的异味具有重要意义[8].此外，蛋白质还通过范德华力、毛细管吸附作用对挥发性成分产生物理吸附[7].以上作用类型与蛋白质及挥发性成分的组成及性质相关，并不存在统一的结合机制[10],且大部分表征为疏水的可逆作用，这也是多肽链的特殊折叠及蛋白质结构趋向稳定的表现。

　　蛋白质与挥发性风味成分的结合机理还有待进一步深入研究，特别是作用位点及作用前后蛋白质的构象变化，目前，作为研究模型的-乳球蛋白也尚未阐明。

许多研究者利用傅里叶红外光谱、核磁共振、平衡透析等分析方法对-乳球蛋白风味结合位点进行研究，证实了-乳球蛋白的风味结合位点多分布在蛋白质疏水区，并且存在多个不同的结合位点以及作用较弱的二次结合位点等。

各类风味成分或结合于蛋白外表面疏水区，或作用于蛋白质中心穴，然而，这些作用位点各自倾向于结合哪种风味成分，对蛋白质的构象的具体影响还不清楚[11-13].Jasinski等[14]报道，-乳球蛋白存在14个2-壬酮的结合位点而其结合常数K值相对较低，并认为结合位点数的增多是由于蛋白质结构伸展导致，但伸展发生的原因还不清楚；

有推测认为是由于风味成分与蛋白质比例增大，蛋白质上的二次结合位点与风味成分发生作用导致结合常数降低，或可能是添加的叠氮化纳对蛋白质-风味成分作用的影响所致[4].

　　2、蛋白质与挥发性成分相互作用的影响因素

　　2.1蛋白质

　　2.1.1蛋白质种类.

　　目前，研究最多的是牛奶中的乳球蛋白，其次是牛血清蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、酪蛋白以及肌原纤维蛋白。

由于氨基酸的组成及侧链结构、蛋白质空间构象的不同，不同种类的蛋白质与挥发性成分的结合存在明显差异。

　　研究最多的风味成分2-壬酮与不同蛋白质的结合常数报道较多，由于实验方法的不同结果存在差异，总体趋势大体为:

牛血清蛋白＞乳球蛋白＞乳白蛋白。

结果显示，乳清蛋白的风味结合能力大于酪蛋白，如乳清蛋白对苯甲醛具有明显的吸附作用，而酪蛋白对其没有任何吸附作用;

乳清蛋白对香草醛、柠檬醛、d-柠檬烯的吸附作用也明显高于酪蛋白。

在乳清蛋白中，乳白蛋白与醛酮类物质的交互作用弱于其它蛋白。

Beyeler等报道大豆蛋白与牛血清蛋白对各类风味化合物表现出类似的结合特性，与乳球蛋白相比，它们与风味成分的作用不受pH值与温度的影响。

肌基质蛋白对干腌火腿的典型风味成分2-甲基丁醛、己醛、辛醛有明显吸附作用，而肌原纤维蛋白则只对辛醛存在明显吸附作用。

不同多肽对风味成分吸附也不同，Gianelli等研究多肽对六种典型肉类风味化合物（2-甲基丁醛，2-戊酮，3-甲基丁醛，己醛，辛醛，甲硫基丙醛）的作用发现肌肽只对2-戊酮没有吸附作用，而鹅肌肽和肌红蛋白只对2-甲基丁醛、3-甲基丁醛具有吸附作用。

然而，研究者们对此类现象没有提供任何解释，显然，研究多组份食品基质的风味吸附特性是一个非常复杂、任重道远的系统工程。

　　2.1.2蛋白质构象.

　　蛋白质的构象发生变化会显着影响其风味吸附特性，任何改变蛋白质构象的理化因素，包括温度、pH值、盐类等不仅影响食品的质构且还会影响蛋白质、多肽与挥发性成分的作用，进而影响风味品质。

　　导变性、加热和冷冻过程会导致蛋白质的构象、疏水性等性质发生变化。

Prez-Juan等提取了新鲜猪肉及干腌火腿的肌基质蛋白与肌原纤维蛋白，并比较了冷冻处理对其风味吸附能力的影响，发现鲜猪肉中的蛋白质风味吸附能力远大于干腌火腿中;

冷冻对不添加甘油的肌动球蛋白与挥发性成分的结合特性有显着影响，而添加甘油保护后则仅发生较小变化;

这表明干腌火腿加工过程蛋白质结构改变影响了其风味吸附特性;

冷冻引起的蛋白质变性导致肌动球蛋白对3-甲基-丁醛，2-甲基-丁醛、2-戊酮的吸附加强，这可能是由于维护蛋白质空间螺旋结构的疏水键断裂后，有更多的疏水基团暴露出来，增强了对非极性及低极性风味成分的吸附，蛋白质与它们的结合为疏水相互作用;

添加甘油的蛋白质对己醛、辛醛的吸附减弱，说明它们与蛋白质作用并非疏水性作用，并且甘油对这类风味成分的结合位点不存在保护作用。

此外，该研究显示聚合态F-肌动蛋白的对大部分风味成分（3-甲基-丁醛，2-甲基-丁醛等）的吸附能力显着高于单体的G-肌动蛋白与肌动球蛋白。

这表明蛋白质分子量的增大、多孔性的增强，对其风味吸附能力有显着影响。

　　Hansen等发现随着温度上升，乳球蛋白对苯甲醛对吸附作用显着增强，并将其归因为热作用导致乳清蛋白结构发生伸展，从而影响其风味吸附能力。

Yang等报道由高压导致变性的乳球蛋白，其风味吸附能力与未变性的蛋白质存在显着差异，这种差异还与风味配体的结构有关。

　　2.1.3蛋白质浓度

　　Prez-Juan等选了六种典型的肉品挥发性风味成分，对不同浓度的肌动球蛋白及G-肌动蛋白与风味成分的作用进行了研究。

发现肌动球蛋白对风味成分均有明显的吸附作用，G-肌动蛋白基本无吸附作用，然而，随着两种蛋白质浓度的增大，不同风味成分浓度发生变化不同。

　　随着蛋白质浓度上升，风味成分释放可能是由于蛋白质与蛋白质之间的作用增强从而减弱蛋白质与风味成分的吸附作用，Damodaran等研究羰基化合物与牛血清蛋白的作用，同样发现随着牛血清蛋白浓度增加，蛋白质之间作用加强，而蛋白质与风味成分配位体间的作用减弱;

此外，也可能是由于蛋白质浓度上升导致表面张力降低，从而风味成分释放增加，ONeill等［26］也指出肌原纤维蛋白是有效的表面张力抑制剂。

　　然而仍有人认为，尽管取决于挥发性风味成分，风味成分保留值应该随着蛋白质浓度上升而增大。

另一方面，蛋白质的浓度发生变化也会影响风味成分与蛋白质间的作用，影响到蛋白质上风味作用位点及二次结合位点的作用及结合常数。

　　2.2挥发性风味成分

　　2.2.1理化性质风味成分的理化、热力学性质对蛋白质与风味成分间作用的影响

　　已经受到广泛关注。

目前，研究的焦点为特定蛋白质对不同种类、及含相同或者不同团的风味成分的作用模式。

风味成分的种类、疏水性、分配系数是影响其与蛋白质相互作用的主要因素。

　　蛋白质对不同种类风味成分的作用大小及方式不同，如添加乳球蛋白能使甲基酮和丁香酚浓度明显降低，而香草醛无显着变化。

一些特定团（如羟基、醛基等）的存在对蛋白质与风味成分的作用存在显着影响。

总体而言，蛋白质对挥发性风味成分的作用强度由醇类到酮类到醛类依次递增。

此外，风味成分与蛋白质间的作用还存在配位体之间的竞争。

　　风味成分的疏水性及分配系数对两者作用的影响较大，但当前研究结果尚存在争议，有待进一步阐明。

　　大量研究表明，乳球蛋白与酯、醛、酮及醇类等物质的结合常数均随着化合物碳链（疏水性）的增长而增加，这也说明两者之间的作用为可逆的疏水相互作用。

然而，Flores等的研究结果显示，风味成分的释放率与其疏水值并无显着相关性。

Prez-Juan等发现对干腌火腿的风味物质，肌动球蛋白及G-肌动蛋白均主要与分配系数K值较低的风味成分结合，但G-肌动蛋白对K值较高的3-甲基-丁醛也存在吸附作用。

Bortnowska发现沙拉酱释放的风味成分强度与其分配系数K值存在显着相关，且不同风味成分与K值的相关性存在差异。

　　2.2.2分子特性对同类化合物，风味成分疏水性越强则与蛋白质的结合越强，对不同种类风味成分的作用还没有相关报导。

风味成分与其异构体同蛋白质的作用程度也不同。

有研究表明，以碳、氢原子的数量、双键、分支程度等为参数，可以建立风味成分的阈值与单功能团之间的模型。

Tan等用偏最小二乘回归法建立了醇类、醛类、酮类、酯类四类风味成分的分子特性与蛋白质（牛血清蛋白）对其吸附作用之间的模型，并通过试验进一步验证了模型的准确性。

由于不同种类风味成分的分子特性差异，建立的吸附模型结构存在差异，而从模型可以看出，酯类与牛血清蛋白的结合主要受到碳原子数及沸点的影响，醛类的结合受到氢原子数与沸点的影响，酮类的结合受到碳原子数、链长及分支程度的影响。

这种模型对研究挥发性风味成分分子特性与吸附作用关系非常直接，可以用于预测同类风味成分与蛋白质的结合作用。

　　2.3其他介质条件的影响

　　2.3.1盐分的添加NaCl作为食品的重要添加成分具有促进保藏、调节风味、提供钠源三个主要功能。

　　它的添加会促进与各类蛋白质作用的风味成分释放，这种盐析现象已被广泛的研究及报导。

Nawar等认为盐溶解时盐离子与水分子作用形成水合外壳，减少了风味成分与水分子的结合促进风味释放;

Kemp等认为NaCl对风味的增效作用是由于某个特别的抑制作用而非提高风味成分浓度;

Ventanas等建立牛肉汤模型也证明了NaCl提高了大部分风味成分的感知强度，然而并未发现Kemp描述的风味抑制效应。

此外，盐类的添加对食品介质的离子强度也有影响，或者导致蛋白质变性等，均会影响到蛋白质与风味成分间的作用。

　　除了NaCl，Prez-Juan等研究了不同种类的盐对肌基质及肌纤维蛋白风味吸附的影响，不同种类的盐对风味吸附影响不同。

添加NaCl后肌基质蛋白作用的各风味成分释放显着增加，KCl只导致了3-甲基-丁醛的释放增加，CaCl2和MgCl2无显着影响;

对于肌原纤维蛋白，KCl导致己醛释放增加，NaCl导致辛醛释放增加，CaCl2和MgCl2对多种风味成分释放有显着提高作用。

蛋白质造成的不同影响可能是由于两者在盐溶液中溶解度不同。

　　2.3.2温度温度主要影响蛋白质的风味吸附能力以及作用位点数，此外还通过影响食品流变学特性与风味成分的分配系数影响风味释放。

温度对吸附作用的影响是在使蛋白质结构变化的基础上，尤其是使蛋白质发生热变性，但不同的作用位点受温度的影响也不同。

　　热处理导致蛋白质发生结构的改变包括伸展及再聚合。

在伸展过程中，包含在折叠结构内部的作用位点可能暴露从而增强蛋白质的风味吸附能力;

之后的再聚合过程，风味成分也可能被再次释放，与蛋白质的作用减弱。

因此，热处理对各类蛋白质与不同的挥发性风味成分的作用影响存在差异，如热处理使乳球蛋白与2-壬酮，乳清蛋白及牛血清蛋白与香草醛的作用减弱;

另一方面，使乳球蛋白与苯甲醛、牛血清蛋白对2-壬酮的作用增强;

而对热稳定的酪蛋白的风味吸附作用基本无影响。

目前，研究温度对蛋白质与风味成分作用的影响大部分是基于温度与受热时间的简单热处理得到的结果，而不能说明整个热处理过程的变化。

温度对蛋白质与风味成分作用的影响还需要进一步研究，特别是对可逆吸附作用。

　　2.3.3pH值pH值对蛋白质与风味成分作用的影响研究较少，目前仅限于乳球蛋白。

pH值变化对蛋白质结构有较大影响，但对不同种类风味成分与蛋白作用影响不同。

　　在酸性pH值下，柠檬烯、月桂烯与乳球蛋白结合减弱，释放增强;

而在pH值9时，蛋白质对甲基酮类、酯类的保留值增大。

有研究显示，在较高的pH值下，风味成分的保留值较大。

Shimizu等研究了不同pH值下乳球蛋白的结构特性，在高pH值下乳球蛋白与风味成分的作用更强。

有人对不同pH值下甲基酮类、酯类与萜类等风味成分的保留值进行了研究，在3～9之间随着pH值增大，风味保留值总体上呈增加趋势，作者推测认为，这是由于高pH值使蛋白质结构发生柔性变化导致风味成分更容易接近蛋白质的一级、二级疏水区域;

然而，在pH值11时风味成分的保留值显着降低，这是由于乳球蛋白的碱变性所致。

　　3、研究技术手段

　　利用风味成分易挥发、不溶于水、受热蒸馏等特性，提取方法主要有超临界流体萃取、蒸馏法、吸附法、浸渍法和吹气冷冻法。

近年来，静态顶空固相微萃取（SPME）用于蛋白质风味吸附分析，具有灵敏度高、快速、廉价等优点，是一种无溶剂样品制备技术，可用于挥发性风味成分检测样品的前处理，对平衡透析后的风味成分进行定量分析，黄建等采用了电子鼻和顶空固相微萃取气质联用技术测定了牡蛎的挥发性风味成分，Adams等利用SPME技术研究热变性、pH对蛋白质与含硫风味化合物间不可逆作用的影响。

　　目前，研究蛋白质与风味成分作用的仪器分析方法主要有顶空气相色谱法、核磁共振法、荧光光谱法、平衡透析法、液相色谱法（排阻色谱、动态耦合柱液相色谱、亲和色谱）、红外光谱法。

此外，也可采用感官评价来辅助分析蛋白质对风味释放的影响。

Tromelin等利用三维定量构象与分子建模来研究蛋白质风味作用位点。

Vreeker等利用大气压化学电离质谱法对鼻腔内的风味释放进行定量分析，研究体内的蛋白质-风味成分作用，并确定作用类型。

　　气相色谱法多与固相微萃取、质谱、电子鼻技术联用，对样品的风味成分进行鉴定，而在研究蛋白质与风味成分相互作用时，多直接采用SPME-GC方法。

　　Gianelli等利用SPME-GC技术研究不同腌制剂对骨骼肌中可溶性蛋白与多肽对挥发性化合物相互作用的影响;

Prez-Juan等在研究蛋白质的种类、浓度、构象对其与风味化合物相互作用的影响时也采用SPME-GC方法。

Jouenne等利用动态耦合柱液相色谱法成功的测定了疏水化合物与环糊精复合常数，Andriot等利用静态顶空分析技术验证了乳球蛋白对苯甲醛的保留作用，利用液相色谱法证实了两者间强烈的交互作用。

平衡透析技术采用不同溶剂一边溶解蛋白质，一边溶解待测风味成分使之达到平衡状态，再通过提出法和气相色谱直接测定风味成分浓度，被用于测定一定数量烷酮类和醛类与牛血清蛋白、大豆蛋白等的结合作用，ONeill等利用此法对乳球蛋白风味结合位点进行研究，Zhou等人综合利用气相色谱、感官分析及平衡透析技术测定了大豆蛋白与黄油风味化合物的相互作用。

Burova等利用差示扫描量热法检测蛋白质风味复合物构象的热稳定性。

光谱技术则被用于研究两者作用的本质，如红外光谱法对研究蛋白质二级结构非常有用;

核磁共振光谱法可以获得蛋白质风味作用位点的相关信息;

Tavel等在研究乳球蛋白与风味化合物作用时，利用傅里叶红外光谱法观察蛋白结合后酰胺汕谋浠耘涮褰猩秆。

倮核磁共振光谱法对选定的不同结构的配体进行结合位点测定。

在不考虑蛋白质或挥发性风味成分自身相互作用的条件下，脉冲梯度场核磁共振技术可以测定蛋白质的吸附常数及作用位点数;

Dufour等利用荧光光谱法检测蛋白质与配位体结合的构象变化以及确定作用位点。

　　4、结论和展望

　　蛋白质可逆或不可逆地与挥发性风味成分结合，影响食品的风味释放。

这种结合作用取决于蛋白质与风味成分的自身特性，蛋白质的浓度、构象，风味成分理化性质都会影响两者的作用机制与程度，不存在统一的作用机制。

pH值、温度、盐分等介质条件也通过与蛋白质作用或改变蛋白质构象等影响其风味吸附能力。

对于研究者来说，探究两者的作用本质与规律是一个系统且复杂的工程。

目前，有关蛋白质与风味成分相互作用的研究取得一定进展，各类蛋白对一些食品典型风味成分的吸附能力研究较为充分，各因素对乳球蛋白风味吸附能力的影响研究也较为全面。

然而，这些研究仍有很多矛盾及不足之处，如风味成分的疏水值及分配系数对二者作用的影响仍存在争议，蛋白质浓度以及热加工过程中蛋白质风味吸附能力的变化尚未阐明，乳球蛋白外的其他蛋白质研究较为缺乏，不同种类的风味成分与蛋白质间作用规律亟待进一步研究。

此外，蛋白质与风味成分的结合机理与作用位点等作用机制方面尚存在很大的不足，许多研究者对蛋白的结合位点数以及大致结合位置进行探究，取得一定成果，但也主要集中在乳球蛋白上，且对各结合位点倾向与何种风味成分作用及作用类型等具体信息尚不清晰。

　　近年来，感官分析及相关仪器分析技术特别是固相微萃取、红外光谱及核磁共振光谱技术在风味研究上的应用取得了较大进步，有助于我们进一步了解蛋白质与挥发性风味成分的作用机制。

一些新的研究手段如添加唾液的口腔模拟、鼻后风味分析、利用风味成分分子特性对蛋白质风味吸附作用建模等方法不断发展应用，对蛋白质等生物大分子对风味的释放与保留研究非常有效。

对各类蛋白而言，当前缺乏的蛋白质风味结合位点的性质及位置方面是未来研究的重点，这也是更好利用蛋白质－风味作用达到改善食品食品风味目的的基础。

在今后的研究中，这些技术及研究手段更需要不断地综合利用，发展与创新，达到有效分析。

除了牛乳蛋白、牛血清蛋白等，肉类蛋白对风味成分的作用已被证实。

随着低脂肉制品的不断发展，研究肉类蛋白质与风味成分作用，了解它们在肉品加工到食用过程中的变化对改善肉品风味有极大意义。

此外，目前研究集中在单一的蛋白质与风味成分的作用。

　　食品基质作为一个复杂体系，在对单一蛋白研究的基础上对复合蛋白体系及多组分食品基质与风味成分作用的研究也是未来发展趋势之一。