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2、一般菌种分离纯化和筛选的步骤是什么?
一般菌种分离纯化和筛选步骤如下:
标本采集-----标本材料的预处理------富集培养------菌种初筛-----菌种复筛-----性能鉴定-----菌种保藏。
3、常用的标本预处理的方法有哪些?
举例说明。
(1)采用热处理方法减少材料中的细菌数
(2)采用膜过滤和离心的方法浓缩水中的细胞
(3)采用化学方法
(4)诱饵法:
将固体基质(如蛇皮、花粉)等加到待检的土壤或水中,待其菌落长出后再铺平板分离。
(5)空气搅拌法:
在空气中搅拌,收集孢子沉淀,如稻草的处理。
4、菌种分离的方法有哪些?
(1)施加选择性压力分离法:
(利用不同种类的微生物对环境和营养要求的不同,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物的生长,而不利于其他种类微生物的生存,以达到使目的菌种占优势,而得以快速分离纯化的目的。
)
分离培养基的效率取决于其养分,pH和加入的选择性抑制剂等。
(2)随机分离方法.
5、施加选择性压力分离法:
又称为增值培养,利用不同种类的微生物对环境和营养要求的不同,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物的生长,而不利于其他种类微生物的生存,以达到使目的菌种占优势,而得以快速分离纯化的目的。
第三章微生物的代谢调节和代谢工程
1、微生物的代谢类型、调节方式、调节部位
代谢类型:
分解代谢和合成代谢
代谢调节方式:
细胞透性的调节;
代谢途径区域化;
代谢流向的调控;
代谢速度的调控。
2、酶活调节和酶量调节的区别
区别:
酶活性调节:
是对现有的酶在活性变化上进行调节,它不会涉及酶量的变化,
酶量的调节:
不涉及现有酶活性的变化,只是通过影响酶合成或酶合成速率以控制酶量变化,达到控制代谢过程的目的。
从调节作用的特点上看:
酶活性调节的效果既及时又迅速,但由于酶量调节涉及到酶蛋白合成,它调节的效果相应地来得慢。
3、酶合成调节的诱导和阻遏、诱导剂、阻遏物
酶合成调节的诱导:
是指在某种化合物作用下,导致某种酶合成或合成速率提高的现象。
酶合成调节的阻遏:
是在某种物质作用下导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。
诱导剂:
能够诱导某种酶合成的化合物称为该酶的诱导剂。
阻遏物:
阻止酶合成的现象称为酶合成的阻遏。
阻遏酶合成的物质称为阻遏物。
4、在工业发酵上如何应用代谢调节理论,试举例
代谢调节理论在工业发酵上的应用主要表现在对发酵工艺条件的控制:
1各种发酵条件对微生物代谢的影响:
各种发酵条件对微生物代谢的影响:
既能影响微生物的生长,又能影响代谢产物的形成,例如在谷氨酸发酵中,发酵条件不同,则发酵生成的主要产物也不同。
2使用诱导物:
可以有效的增加相应酶的产量。
如加入木糖诱导半纤维素酶和葡萄糖异构酶的生成等。
3添加生物合成的前体:
自身的结构无多大变化,但却能促进产物合成。
如青霉素G的生产中,苯乙酰-CoA是限速性因子,补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。
④对培养基成分和浓度的控制:
在考虑培养基组成与各组成成分的比例时,要保证能够满足机体生长的需要,要有利于代谢产物的形成,同时还要尽量避免使用高用量的这种物质。
例如用甘油代替果糖作碳源培养嗜热脂肪酵母,可以使淀粉酶产量提高25倍以上。
5、前体与诱导物的区别
前体与诱导物的区别:
1概念区别:
②一般,可把那些能在生长期内、生产期前促进产物合成的化合物看做诱导物,而前体往往只在生产期内起作用。
③另外,诱导物可以被非前体的结构类似物取代。
6、次级代谢的调节主要有哪些方式
初级代谢对次级代谢的调节;
碳代谢物的调节作用;
氮代谢物的调节作用;
磷酸盐的调节作用;
次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用;
次级代谢中细胞膜透性调节。
(不确定)
7、代谢工程及三种方式
代谢工程是指利用基因工程技术,定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造,以改变微生物的代谢特性,并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合,构建新的代谢途径,生产新的代谢产物的工程技术领域。
三种方式:
改变代谢途径;
扩展代谢途径;
构建新的代谢途径。
8、前体
前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物,能被微生物直接结合到产物分子中去,而自身的结构无多大变化,且具有促进产物合成的作用。
第四章优良菌种选育
1、菌种选育的方法及原理。
(1)自然选育:
不经人工处理,利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程,一般由两种原因引起:
多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。
(2)人工选育:
①诱变育种:
就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞,提高基因突变频率,再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。
诱变育种的理论基础是基因突变,突变主要包括染色体畸变和点突变二大类。
②杂交育种:
杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合或接合,使遗传物质重新组合,从中分离和筛选具有新性状的菌株。
③原生质体融合:
首先用酶分别酶解两个出发菌株的细胞壁,在高渗环境中释放出原生质,将它们混合,在助溶剂或电场作用下,使它们互相凝集,发生细胞融合,实现遗传重组。
④基因工程:
将外源DNA通过体外重组后,导入受体细胞,使其在受体细胞中复制、转录、翻译表达的技术称为基因工程或DNA体外重组技术。
第五章菌种保藏的原理和方法
1、菌种衰退的主要原因
菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。
2、防止菌种衰退的方法
①控制传代次数
②选择合适的培养条件
③利用不同类型的细胞进行传代
④选择合适的保藏方法
3、菌种保藏的原理及方法
原理:
菌种保藏主要是根据微生物的生理、生化特性,在人工创造的条件下使其代谢处于不活泼的休眠状态,生长繁殖受到抑制。
这样就能尽可能地减低菌种的变异率。
方法:
菌连续在培养基上(内)移种
种生活态传代培养保藏法连续在活宿主上(内)移种
保固体斜面
藏湿法半固体琼脂柱
方休眠态液体介质(蒸馏水、糖液、其它溶液)
法藏在玻璃管内
干法吸附在合适的载体上
4、菌种复壮的措施
菌种的复壮措施:
①纯种分离:
(平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等)。
②通过寄主体内生长进行复壮;
③淘汰已衰退的个体(采用比较激烈的理化条件进行处理,以杀死生命力较差的已衰退个体)。
第六章培养基(重点是培养基的类型与功能以及一般培养基的设计思路与优化)
1、孢子培养基、种子培养基和发酵培养基及基本配制要求
孢子培养基:
是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基,它能使菌体迅速生长,产生较多优质的孢子,且不易引起菌种发生变异。
所以对孢子培养基的基本配制要求是:
(1)营养不要太丰富(特别是有机氮源),否则不易产孢子。
(2)所用无机盐的浓度要适量,不然也会影响孢子量和孢子颜色。
(3)要注意孢子培养基的pH和湿度。
种子培养基:
是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体,并使菌体长得粗壮,成为活力强的“种子”。
所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全,氮源和维生素的含量也要高些,成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH,其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。
发酵培养基:
是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
它既要使种子接种后能迅速生长,达到一定的菌丝浓度,又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。
因此,发酵培养基的组成除了有菌体生长所必需的元素和化合物外,还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
发酵培养基的要求:
①培养基能够满足产物最经济的合成。
②发酵后所形成的副产物尽可能的少。
③培养基的原料应因地制宜,价格低廉;
且性能稳定,资源
丰富,便于采购运输,适合大规模储藏,能保证生产上的
供应。
④所选用的培养基应能满足总体工艺的要求,如不应该影响
通气、提取、纯化及废物处理等。
附加:
培养基的种类:
(1)按培养基的组成成分:
合成培养基,多用于研究与育种,但营养价值单一,价格较高,不适宜大规模生产;
天然培养基,原料来源广泛、简单,如黄豆饼粉、蛋白胨等,营养丰富,价格低廉,适宜工业生产。
(2)按培养基的状态:
固体培养基,主要用于菌种的培养和保存,也广泛用于产生子实体真菌的生产,如香菇;
半固体培养基:
主要用于菌种鉴定、细菌运动型观察和噬菌体的效价滴定;
液体培养基,因为有利于氧和物质的传递,所以适宜大规模生产。
(3)按用途:
包子培养基,种子培养基,发酵培养基。
2、了解发酵培养基的组成,发酵培养基常用的原料以及其中的基本概念。
碳源:
葡萄糖,糖蜜,淀粉、糊精,
氮源:
无机氮源:
氨盐、硝酸盐和氨水;
有机氮源:
花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。
无机盐的微量元素;
生长因子、前体和产物促进剂;
水。
3、掌握发酵培养基优化与设计的思路
4、C、N比
5、补料的作用
补料的作用:
丰富培养基,避免了菌体过早衰老,使产物合成的旺盛期延长;
控制了pH值和代谢方向;
改善了通气效果,避免了菌体生长可能受到的抑制;
补料还能补足发酵液的体积。
6、促进剂
促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物,又非前体,但加入后却能提高产量的添加剂。
老师补充种子扩大培养
1、什么是种子扩大培养?
种子扩大培养是指将保存的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
2、种子扩大培养的目的是什么?
目的:
使发酵周期缩短,设备利用率提高。
3、何谓种子接种龄、接种量?
接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
4、为什么种子要逐级扩大培养?
5、影响种子质量的因素有哪些?
孢子的质量;
培养基;
培养条件;
种龄;
接种量。
6、保证种子质量有哪些措施?
因此首先必须保证生产菌种的稳定性;
其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入。
7、种子好坏的判断
答案应该是:
作为种子的准则是:
1)菌种细胞的生长活力强,移种至发酵罐后能迅速生长,延滞期短
2)生理性状稳定
3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求
4)无杂菌污染
5)保持稳定的生产能力。
8、种子的制备工艺
图示
文字说明:
实验室种子制备:
(1)对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子,孢子可直接作为种子罐的种子。
(2)对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种,可以用摇瓶液体培养法。
(3)对于不产孢子的细菌,生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。
然后再用茄子瓶固体斜面或摇瓶液体扩大培养。
生产车间种子制备:
实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养,种子罐的培养基虽因不同菌种而异,但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等,如果是需氧菌,同时还需供给足够的无菌空气,并不断搅拌,使菌(丝)体在培养液中均匀分布,获得相同的培养条件。
第七章发酵工艺控制(重点是5个工艺条件对发酵的影响及如何控制,自己看书,92页)
1.温度对发酵的影响主要表现在哪些方面?
温度对发酵的影响是多方面的,主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方向等方面。
2.PH对发酵的影响以及如何控制?
PH对发酵的影响:
发酵液的PH变化,对菌体的生长繁殖和产物积累的影响很大。
另外PH还会影响菌体的形态,影响细胞膜的电荷状态,引起膜的渗透性发生变化,进而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形成。
PH对产物的稳定性亦有影响,对某些生物合成途径也有影响。
在发酵过程中可通过以下方式来控制pH:
(1)调节基础培养基的配方
调节碳氮比(C/N)
添加缓冲剂
(2)补料控制
直接加酸加碱
补加碳源或氮源
3.为何说溶氧可作为发酵异常情况的指示?
(1)发酵中污染好气性杂菌。
溶氧会一反往常在较短的时间内,如2—5小时跌到零附近。
跌零后长时间不回升。
这比无菌试验预报几乎提前4—5个小时。
(2)中间补料是否得当可以从溶氧变化看出。
(3)操作故障或事故引起的发酵异常现象,也能从溶氧变化中得到反映。
4.氧对发酵的影响以及如何控制发酵液中的溶氧?
氧对发酵的影响:
溶解氧浓度过低,代谢异常,产量降低。
溶解氧浓度过高,代谢异常,菌体提前自溶。
溶氧控制的措施:
(1)调节通风与搅拌;
(2)限制基础培养基的浓度,使发酵器内的生物体浓度维持于适当水平;
(3)以补料方式供给某些营养成分来控制菌体生长率和呼吸率。
5.二氧化碳对发酵有何影响?
如何控制?
①对发酵促进。
如牛链球菌发酵生产多糖,最重要的发酵条件是提供的空气中要含5%的CO2。
②对发酵抑制。
如对肌苷、异亮氨酸、组氨酸、抗生素等发酵的抑制
③影响发酵液的酸碱平衡
控制方法:
提高通气量和搅拌速率,有利于CO2的排出。
降低通气量和搅拌速率,有利于提高CO2在发酵液中的浓度。
CO2的产生与补料控制有密切关系。
如补糖可降低发酵液中CO2的浓度,并降低培养液的pH值。
6.泡沫给发酵带来的副作用主要表现在那些方面,如何控制?
1)降低了发酵罐的装料系数。
2)增加了菌群的非均一性
3)增加了污染杂菌的机会
4)导致产物的损失
5)消沫剂的加入将给提取工序带来困难。
泡沫控制的方法可归结为机械消沫和消沫剂消沫两大类。
也有从微生物本身的特性着手,防止泡沫的形成,如选育或混养。
老师的补充染菌的控制
1、工业发酵中可能的染菌途径及如何防止染菌(没写,自己看)
种子带菌:
种子带菌可使发酵染菌具有延续性
种子带菌的防治:
严格控制无菌室的污染;
对每一级种子进行严格的无菌检验;
种子培养基和器具严格灭菌.
空气带菌:
空气带菌也使发酵染菌具有延续性,导致染菌范围扩大至所有发酵罐;
空气带菌的防治:
主要是完善空气净化系统;
加强卫生管理;
设计合理的空气预处理工艺;
设计和安装合理的空气过滤器,防止过滤器失效。
培养基或设备灭菌不彻底:
一般为孤立事件,不具有延续性;
培养基或设备灭菌不彻底导致染菌的防治:
淀粉质原料:
防止“夹心”;
固形物含量高的原料:
防止发酵罐壁或罐内支架上堆积;
灭菌时罐内空气未排除;
蒸汽压力波动过大(连续灭菌);
泡沫冒顶导致灭菌不彻底。
设备渗漏:
这种途径造成染菌的危害性较大;
设备渗漏导致染菌的防治方法:
放罐后要认真清洗发酵罐;
控制冷却水质量,降低其中氯离子含量;
对发酵罐定期检查、试漏,及时发现漏隙。
发酵操作的疏漏。
防治方法:
规范操作。
第八章发酵过程的参数检测和自动控制
1.发酵过程的参数分为哪几类?
各举几个例子。
答物理参数:
温度、生物热、搅拌转速、搅拌功率、通气量、罐压、发酵液粘度、消沫剂、发酵液计量等
化学参数:
pH、溶氧、CO2浓度、细胞浓度、基质浓度、产物浓度和尾气组成
生物参数:
菌体干细胞浓度,菌体干细胞中DNA、RNA含量;
细胞形态
间接参数:
摄氧率,二氧化碳生成率,呼吸商
2.什么是传感器?
传感器的作用是什么?
传感器通常是指能够将非电信号转换为电信号的器件。
传感器的作用是感受被测量的变化,并直接从被测对象中提取检测信息,也即将来自外界的各种信号转换成电信号。
3.测定DO的氧电极需满足那些条件?
其读数有那些表示方法?
一个基本的DO电极测量系统不仅具备指示电极和参比电极形成的电位差,使此时只有氧中电极上发生反应,而且要使电极表面与液流主体间有一个稳定的氧扩散梯度。
其读数的表示方法有:
百分饱和浓度表示法,氧分压表示法,氧浓度表示法。
4.菌浓度的测定有那些方法?
在使用浊度法测量菌的浓度时要注意那些问题?
离线取样分析的方法:
称重法,离心叠集法,光学(浊度)法,细胞蛋白质测定法,核酸测定法,ATP测定法,染色计数法,平板培养法等
在线测量的方法:
(1)浊度法
(2)荧光测量
5、为何要测量和控制发酵过程中的pH值?
6、发酵用的复合pH电极必须满足那些特殊要求?
电极必须能耐高温灭菌;
具有长时间稳定性;
要求结构紧凑、便于安装和耐受压力。
7、发酵过程的自动控制包括哪三方面内容?
与发酵过程的未来状态相联系的控制目标。
如T、pH等。
一组可供选择的控制动作。
如阀门的开关等。
能够预测控制动作对过程状态影响的模型。
8、溶氧电极应满足的特殊要求:
根据发酵过程实际使用要求,对氧电极具有如下要求:
1)在长时间内能稳定工作;
2)电极输出电流足够大并与DO成正比;
3)电极功能受液流影响小;
4)电极响应快速灵敏;
5)测量时不易受培养基中温度的影响;
6)电极必须能耐高温(不超过120℃)灭菌消毒;
7)电极应具有合理的结构和合适的外形。
第九章微生物反应动力学
1、据动力学分型方法,可将分批发酵过程分为哪三个类型?
各有何特点?
生长关联型:
菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰,即表现出产物形成直接与碳源利用有关。
部分生长关联型:
在发酵的第一时期菌体迅速增长,而产物的形成很少或全无;
在第二时期,产物以高速度形成,生长也可能出现第二高峰,碳源利用中这两个时期都很高。
非生长关联性:
产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期,即稳定期。
产物形成与碳源利用无准量关系,产量远远低于碳源的消耗量。
2、何谓分批培养?
可分为哪几个时期?
分批培养指的是一次投料,一次接种,一次收获的间歇培养方式。
(是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后,接入少量微生物菌种进行培养,使微生物生长繁殖,在特定条件下完成一个生长周期的微生物培养方法。
优点:
操作简单;
操作引起染菌的概率降低;
不会产生菌种老化和变异等问题。
缺点:
非生产时间长,设备利用率低。
可分为的几个时期及其特点如下:
1)延滞期:
刚接种后的一段时间内,几乎未见菌体浓度的增加。
2)对数期:
细胞的生长不受到限制,细胞浓度随培养时间指数增长。
3)减速期:
从指数生长到生长稳定期有一过渡,称为减速期。
4)稳定期(静止期):
菌体代谢十分活跃,许多次级代谢产物在此期合成,也被称为生产期或分化期。
5)衰亡期:
细胞开始死亡,活细胞的浓度不断下降。
3、什么是补料分批发酵、连续发酵?
各有何优缺点?
补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵,是指在分批发酵过程中,间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。
1)使发酵系统中维持很低的基质浓度;
2)不会产生菌种老化和变异等问题。
1)存在一定的非生产时间;
2)和分批发酵比,中途要流加新鲜培养基,增加了染菌的危险。
连续发酵:
培养基料液连续输入发酵罐,并同时放出含有产品的相同体积发酵液,使发酵罐内料液量维持恒定,微生物在近似恒定状态(恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率)下生长的发酵方式。
1)可以提高设利用率和单位时间的产量,节省发酵罐的非生产时间。
2)发酵中各参数趋于衡值,便于自动控制。
3)易于分期控制。
可以在不同的罐中控制不同的条件。
1)容易染菌:
发酵周期长,杂菌污染机会多。
2)容易引起菌种的变异,使生产能力下降:
长时间的培养,也就是多次数的传代,培养条件的变化等。
4.连续培养中µ
与D之间有何关系?
(不全面,具体参看课本176页)
单级连续培养中进入稳定状态后,细胞的µ
与D相等。
5.连续培养又可分为哪些类型?
按设备:
可分为罐式、管式;
按控制方法:
恒成分培养、恒浓度培养;
按菌种:
循环式、非循环式;
按发酵罐的级数:
单级或多级连续培养。
第十章微生物下游加工工程概论
1.微生物工程下游加工工程有何特点?
1).培养液中所含欲提取的生物物质浓度很低,杂质含量却很高。
2)下游加工过程的代价昂贵,回收率不高;
3)欲提取的生物物质通常很不稳定。
遇热、极端pH、有机溶剂会引起失活或分解。
4.)发酵或培养都是分批操作、生物变异性大,各批发酵液不尽相同,这就要求下游加工有一定的弹性,特别是对染菌的批号,也要能处理。
2.微生物工程下游加工过程应遵循哪几条原则?
是胞内产物还是胞外产物;
原料中产物和主要杂质浓度;
产物和主要杂质的物理化学特性及差异;
产品用途和质量标准;
产品的市场价格;
废液的处理方法等.
3.微生物工程下游加工工程的一般程序
微生物工程下游加工过程—般说来可分为4个阶段:
1)培养液(发酵液)的预处理和固液分离;
2)初步纯化(提取);
3)高度纯化(精制);
4)成品加工。
具体流程如下:
发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离提取(初步纯化)精制(高度纯化)成品加工结
加热沉降均化离心分离沉淀层析、憎水无菌过滤、晶
调PH离心分离研磨萃取吸附离子交换、吸附浓缩、喷雾
絮凝过滤融胞过滤萃取亲和、电泳超滤、干燥
错流过滤错流过滤超滤冷冻干燥
第十一章发酵液的预处理和过滤
1.发酵液预处理的目的是什么?
1)改变发酵液的物理性质,加快悬浮
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