CLSI临床微生物实验室标准解1Word文档下载推荐.docx

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这是因为纸片扩散法不能区分万古霉素敏感、中介耐药的葡萄球菌。

图2显示采用Etest测定万古霉素对金葡菌的MIC为8mg/ml，为“I”，而采用纸片扩散法，抑菌圈直径为17mm，为“S”。

万古霉素纸片扩散法仅仅对于检测含vanA的金葡菌（VRSA）是可靠的。

如果抑菌圈直径7mm，需要检测万古霉素的MIC值。

对万古霉素MIC值升高的金葡菌（MIC4mg/mL）和CoNS（MIC8mg/mL）需要送往参考实验室进一步确证。

目前的研究没有重新评估替考拉宁纸片扩散法的折点，因此纸片扩散法能否将替考拉宁中介、耐药的葡萄球菌与敏感的菌株区分开来还不清楚。

2009CLSI明确指出采用含6mg/ml万古霉素脑心浸液（BHI）琼脂筛选万古霉素MIC8mg/ml的金葡菌，具体步骤如下：

制备含6mg/ml万古霉素脑心浸液（BHI）琼脂，将待测菌株调整到0.5麦氏单位菌悬液，用加样枪吸取10ml菌悬液点种到制备好的琼脂板上，或者是用菌悬液浸湿棉签并拧干多余的液体，在制备好的琼脂板上点种直径10-15mm的面积，352空气孵育24小时，1个菌落或薄膜生长即可推测为万古霉素敏感性下降金葡菌。

进一步的试验是用确证的MIC方法检测在筛选平皿上生长金葡菌对万古霉素的MIC值。

BHI琼脂筛选法不能稳定地检测所有万古霉素中介金葡菌，一些万古霉素MIC为4mg/ml的金葡菌不能在琼脂板上生长。

推荐的质控菌株是粪肠球菌ATCC29212（敏感）和粪肠球菌ATCC51299（耐药）。

异质性万古霉素中介金葡菌（hVISA）是指子代中含万古霉素MIC值8-16mg/ml的细胞，大多数发生于万古霉素治疗的病人，hVISA可能造成万古霉素治疗失败。

采用标准的万古霉素MIC试验，一些hVISA的MIC值在1-2mg/ml之间，CLSI中还没有检测hVISA的特异方法。

图2采用CLSIM100-S18万古霉素纸片扩散法折点，将“I”金葡菌错误地判断为“S”（此图片来自JanetHindler教授的幻灯片）三、达托霉素药敏试验CLSI规定采用肉汤稀释法检测达托霉素MIC值，使用的培养基是CAMHB，需要将Ca2+调整至50mg/mL。

葡萄球菌属对达托霉素的MIC折点只定义敏感范围（1mg/mL），目前没有中介和耐药的折点。

菌株MIC值高于敏感折点被定义为不敏感（nonsusceptible）。

实验室如果碰到达托霉素不敏感株，需要重新鉴定菌株和检测药敏，然后送往参考实验室进一步确认。

2009年CLSI指出纸片扩散法检测达托霉素不可靠，琼脂稀释法用于达托霉素还没有被批准。

四金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的筛选莫匹罗星属于pseudomonicacid类抗生素，主要用于皮肤感染（如脓疱病）治疗和金葡菌鼻腔定植的清除，不需要常规检测药敏，仅仅在特别必要时检测。

2009年CLSI提出要筛选金葡菌对莫匹罗星的高水平耐药（见表2）。

研究表明莫匹罗星对金葡菌MIC512mg/mL，与定植不能清除相关。

虽然此文件没有定义莫匹罗星敏感性的具体折点，但纸片扩散法和MIC筛选法可以鉴定莫匹罗星MIC值512mg/mL菌株。

表2金葡菌莫匹罗星高水平耐药筛选试验纸片扩散法筛选MIC筛选200mg莫匹罗星纸片单孔-256mg/mlMHA，35空气孵育24h微量肉汤稀释法，35空气孵育24h无抑菌圈：

高水平耐药有抑菌圈：

非高水平耐药生长：

高水平耐药不生长：

非高水平耐药金葡菌ATCC25923（200mg纸片）mupA阴性（抑菌圈直径29-38mm）金葡菌ATCCBAA1708mupA阳性（无抑菌圈）金葡菌ATCC29213mupA阴性（MIC0.06-0.5mg/mL）粪肠球菌ATCC29212mupA阴性（MIC16-128mg/mL）金葡菌ATCCBAA1708mupA阳性（不生长）链球菌CLSI临床微生物实验室标准解读第二辑CLSI的链球菌属药敏解读北京协和医院杨启文王辉对于链球菌属，CLSI将药敏分为3个部分：

肺炎链球菌的药敏解读、b溶血链球菌的药敏解读和草绿色链球菌的药敏解读。

不用的菌种CLSI有不同的规定，现对链球菌属的CLSI药敏作逐一解读：

1.肺炎链球菌：

（1）肺炎链球菌对青霉素和其他b内酰胺类药物的敏感性检测CLSI对该组合的解释标准按照感染类型和给药途径不同分为三类（表1），3种情况均有不同的折点。

对于非脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI认为对于青霉素MIC2g/ml的菌株，肾功正常的成年人，应每次至少应用200万单位，每四小时给药一次（每天1200万单位）的方式进行治疗。

对于MIC为4g/ml的菌株则须将剂量提高至每天1800-2400万单位。

对于非脑脊液标本中分离出的肺炎链球菌，需同时使用脑膜炎和非脑膜炎的折点来报告青霉素的敏感性。

对于脑膜炎的青霉素静脉给药治疗，CLSI认为需将青霉素用量提高至最大（如肾功正常的成年人可使用每次300万单位，每四小时一次的给药方式）。

对于脑脊液中分离的肺炎链球菌，仅需采用脑膜炎的折点报告青霉素的敏感性。

常规工作中可以用含5%脱纤维羊血的Mueller-Hinton平皿进行苯唑西林的纸片扩散法来检测青霉素的敏感性。

苯唑西林的抑菌圈直径20mm时，可以判定青霉素为敏感（相当于青霉素的MIC0.06mg/ml）。

但纸片扩散法不能用于区分耐药菌株和低耐菌株，因此抑菌圈直径19mm的菌株可能是青霉素耐药或中介甚至是敏感的菌株，对于这些菌株应该进行肉汤或琼脂稀释试验测定青霉素的MIC。

需要注意的是，苯唑西林纸片扩散法是用来预测青霉素敏感性的，苯唑西林MIC本身无价值，因此无需测定苯唑西林的MIC。

对于非脑膜炎的菌株，青霉素的MIC可以预测下列内酰胺类药物的敏感性：

青霉素MIC0.06mg/ml（或苯唑西林抑菌圈直径20mm）提示菌株对氨苄西林（口服或肠外）、氨苄西林-舒巴坦、头孢克罗、头孢地尼、头孢妥仑、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢唑肟、头孢呋辛、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感；

青霉素MIC2g/ml提示菌株对阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松和厄他培南也敏感。

表1.青霉素对肺炎链球菌的敏感性判定折点（g/ml）必须注意，虽然阿莫西林、氨苄西林、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛、厄他培南、亚胺培南和美罗培南可用于治疗肺炎链球菌感染，但对这些药物尚无可靠的纸片法药敏试验，最好用MIC法测定其体外抗菌活性。

对于脑脊液中分离出的肺炎链球菌，需尽快用可靠方法检测和报告青霉素和头孢噻肟（或头孢曲松或美罗培南）的MIC值。

这些菌株也需要用MIC法或纸片扩散法报告万古霉素的药敏结果。

表2.从脑脊液中分离到的肺炎链球菌需常规报告药物的折点

（2）肺炎链球菌对非内酰胺类药物的敏感性CLSI对大环内酯类药物的红霉素、阿奇霉素、克拉霉素和地红霉素给出了纸片扩散法和MIC法的折点，并指出红霉素的敏感耐药性可以预测阿奇霉素、克拉霉素和地红霉素的敏感耐药性。

对于尿路分离的菌株，常规不报告大环内酯类药物的敏感性。

对于临床常用的氟喹诺酮类药物，CLSI提供了纸片扩散法和MIC法的折点。

并提示：

对左氧氟沙星敏感的肺炎链球菌可预测对吉米沙星和莫西沙星也敏感。

然而，对吉米沙星或莫西沙星敏感的肺炎链球菌不能认为对左氧氟沙星也敏感。

2.溶血链球菌CLSI在此部分的描述中，溶血链球菌包括携带A群（化脓链球菌）、B群（无乳链球菌）、C群或G群抗原的大菌落化脓性菌株。

而携带A、C、F或G抗原的小菌落溶血菌株（咽峡炎链球菌，以前称之为米勒链球菌）则归属于草绿色链球菌群，药敏折点也应参照草绿色链球菌群。

对于化脓链球菌（A群）或无乳链球菌（B群），青霉素和其他内酰胺类药物的药敏试验不需常规进行。

这时由于目前还没有耐药菌株的报道。

CLSI表格中所列出的折点仅是为了药物研发、流行病学以及监测耐药性的目的。

任何测定为非敏感的菌株均需送至参考实验室进行确证。

假如菌株对青霉素敏感，则可以预测对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、头孢克罗、头孢唑啉、头孢地尼、头孢吡肟、头孢丙烯、头孢噻肟、头孢布烯（仅对A群链球菌）、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢拉定、头孢噻吩、头孢匹林、厄他培南、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感，不必再进行这些药物的敏感性试验。

对于厄他培南、美罗培南和达托霉素，CLSI不推荐使用纸片扩散法实验，也没有提供纸片法的判定折点。

怀孕期妇女B群链球菌的预防用药推荐为青霉素或氨苄西林。

对于过敏反应低危的妇女，若对青霉素过敏可改用头孢唑啉；

对于过敏反应高危的妇女，若对青霉素过敏则改用克林霉素或红霉素。

B群链球菌对氨苄西林、青霉素和头孢唑啉敏感，但可能对克林霉素和/或红霉素耐药。

当对青霉素过敏反应高危的怀孕期妇女分离出B群链球菌时，需对克林霉素和红霉素进行药敏试验并报告。

大环内酯类耐药的溶血链球菌可以体现出对克林霉素的结构型或诱导型耐药由erm基因介导的23SrRNA甲基化，也称为MLSB（大环内酯-林可霉素-链阳霉素B）耐药，或仅对大环内酯类耐药（由mef基因介导的外排泵机制）。

诱导型克林霉素耐药可以用D试验检测：

按照标准的纸片扩散法程序，在15mg红霉素纸片周围贴2mg克林霉素纸片，两纸片的边缘相距12mm，孵育后，若克林霉素纸片抑菌圈靠近红霉素一侧未出现切割现象，则报告菌株对克林霉素敏感。

若克林霉素纸片抑菌圈靠近红霉素一侧出现切割现象（D形抑菌圈），则表克林霉素可被诱导耐药。

这样的菌株应报告为“克林霉素耐药”，另外，报告中还应附上以下内容：

“该菌株可诱导出对克林霉素的耐药性。

但在某些病人中，使用克林霉素可能仍然有效。

”3.草绿色链球菌群假如菌株对青霉素敏感，则可以预测对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林克拉维酸、氨苄西林舒巴坦、头孢克罗、头孢唑啉、头孢地尼、头孢吡肟、头孢丙烯、头孢噻肟、头孢布烯（仅对A群链球菌）、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢拉定、头孢噻吩、头孢匹林、厄他培南、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南也敏感，不必再进行这些药物的敏感性试验。

对于青霉素、氨苄西林、厄他培南、美罗培南和达托霉素，CLSI不推荐使用纸片扩散法实验，也没有提供纸片法折点。

从常规无菌部位（如脑脊液、血液、骨髓）分离出的草绿色链球菌需尽快用MIC法检测青霉素的敏感性。

对青霉素或氨苄西林中介的菌株需与氨基糖苷类药物进行联合治疗以达到杀菌效果。

4.CLSI对链球菌属的药敏通用规则：

CLSI对链球菌属的药敏有一些通用规则，综述如下：

（1）下列抗菌药物不能常规用于报告脑脊液感染菌株，这些药物治疗脑脊液感染无效，包括a.仅可口服的药物b.第一代和第二代头孢菌素（除了静脉用头孢呋辛以外）c.克林霉素d.大环内酯类e四环素类f.氟喹诺酮类

（2）若用纸片扩散法进行链球菌的药敏试验，则需测量肉眼判断能完全抑制菌落生长的抑菌圈直径。

抑菌区域以肉眼观察无明显可见的菌落。

测量时将平皿盖子打开，通过反射光从琼脂的上表面测量抑菌圈。

忽略抑菌圈边缘的针尖样、只可通过放大镜观察到的菌落。

（3）对于一些菌种/抗菌药物组合，发生“非敏感”的几率极低。

这些菌种若产生非敏感的结果，则需再次确认菌株的鉴定和药敏试验。

这些菌株需保存并送至参考实验室确证。

（4）链球菌的不常见表型：

菌种或菌群未报道的表型，不常见的表型和/或技术错误导致的结果在特殊地区不常见的表型和/或技术错误导致的结果肺炎链球菌氟喹诺酮类耐药青霉素耐药利奈唑胺非敏感*第三代头孢菌素耐药万古霉素非敏感*链球菌，氨苄西林或青霉素非敏感*beta群第三代头孢菌素非敏感*达托霉素非敏感*利奈唑胺非敏感*万古霉素非敏感*链球菌，viridans群达托霉素非敏感*青霉素中介或耐药利奈唑胺非敏感万古霉素非敏感*笔者注释：

CLSI药敏试验和折点需要不断更新和完善，各位临床微生物室的同仁们，如果在常规药敏试验中，发现CLSI指南有任何问题或疑问，请发Email至wh_（王辉），笔者很愿意将这些问题提交至CLSI年度工作会议中进行讨论；

同时CLSI也希望听到中国用户的反馈和意见。

CLSI2010更新CLSI临床微生物实验室标准解读第三辑2010年CLSI药敏试验的更新中国医学科学院北京协和医学院杨启文王辉美国临床与实验室标准化研究所（TheClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）是一个国际性、跨学科、非营利的、致力于发展操作标准的教育组织。

其抗菌药物敏感性试验小组委员会（SubcommitteeonAntimicrobialSusceptibilitytesting）每年组织该领域专家和药厂代表等对药敏相关文件M100进行一次修订。

目前我国的临床微生物实验室均以CLSI文件作为药敏指导文件进行试验操作和报告，本文将CLSIM100-S20（2010年）的主要更新点总结如下：

一、主要格式的更新：

下表显示了一些在M100-S19（2009年）中位于最后的附录在M100-S20（2010年）文件中新的命名、编号和位置。

表1.M100-S20的格式更新M100-S19中的名称M100-S20名称/位置附录A（ESBLs的筛选和确证试验）补充性表格2A-S1/表2A的最后附录G（碳氰酶烯酶的筛选和确证试验）补充性表格2A-S2/表2A的最后附录B（金黄色葡萄球菌的筛选试验）补充性表格2C-S3/表2C的最后附录C（凝固酶阴性葡萄球菌的筛选试验）补充性表格2C-S4/表2C的最后附录D（肠球菌的筛选试验）补充性表格2D-S5/表2D的最后附录E（药敏结果的确证建议）附录A/M100-S20的最后，术语表前附录F（药敏试验的质控菌株）附录B/M100-S20的最后，术语表前二、表1和表2介绍内容中的更新

（1）修订了“非敏感”的定义：

M100-S20中对“非敏感”的定义是由于耐药菌株缺失或稀少因而仅确立了敏感性解释标准。

当药物对菌株的MIC高于或抑菌圈直径低于此折点时需报告为非敏感。

非敏感并不意味着菌株携带某种耐药机制。

有可能MIC高于敏感折点的菌株缺乏耐药机制并且属于野生菌株，只不过其出现于敏感性折点确立后。

对于“非敏感”的菌株，菌株鉴定和药敏结果需被再次确认。

（2）对“使用头孢噻吩的折点仅用于预测对其他头孢菌素的敏感性”增加注释：

在M100-S20中，头孢噻吩的折点仅可用于预测菌株对口服药物，包括孢羟氨苄，头孢泊肟，头孢氨苄和氯碳头孢的敏感性。

旧的数据认为头孢噻吩的结果可以预测某些其他头孢菌素的敏感性可能仍然正确，但目前的数据尚不能支持此论点。

（3）在M100-S20的第26页增加第VII部分来描述筛选试验并总结他们的局限性以及对应的确证试验。

该部分总结了肠杆菌科菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌和肺炎链球菌的耐药表型初筛试验和对应的确证试验。

（4）在表1和1A的警告框内，M100-S20将头霉素类药物加入脑脊液分离菌株中不能常规报告的抗菌药物列表中。

在M100-S19中，口服抗菌药物、第一代和第二代头孢菌素（除外静脉用头孢呋辛）、克林霉素、大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类被列为脑脊液分离菌株中不能常规报告的抗菌药物，因为这些药物不是脑脊髓感染的选择药物，在M100-S20中，头霉素类药物（如头孢西丁、头孢美唑和头孢替坦）也被纳入此类药物。

三、肠杆菌科菌相关的更新

（1）修订了头孢唑啉、头孢噻肟、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松和氨曲南的折点，并在折点后增加了对应的用药方案。

修订折点的原因在CLSI文件M100-S20的第17页有一个关于折点如何建立的简短注释。

本段话参考的是CLSI关于折点发展的指南性文件：

M23体外药敏试验标准和质量控制参数的发展。

简单地说，修改折点涉及微生物学、药理学和临床数据的系统性回顾。

公认的专家，制药业赞助商和监管机构参与这一过程，其中包括CLSI药敏试验小组委员会每年两次的在公开会议讨论。

若为新的药物建立原始折点，对照的临床试验数据是必需的。

然而在修改折点时，虽然对照临床试验是可取的，但在处理快速变化的细菌耐药机制和“老”的药物时这些试验往往并不可行。

因此，小组委员会必须依赖于由发表的文献资料、专家意见和共识所支持的最佳实践。

流行病学、临床实践以及任何折点修订的监管影响必须予以考虑。

折点需要修订是由于不断变化的耐药机制和细菌菌群分布，不断进步的科学增进了人们对临床反应药理学因素的认识以及“最佳治疗”被临床医生所接受。

在临床实践中常规使用的许多药物折点源于25年前的临床操作，而这些操作以今天的监管和质量保证标准来看是不可接受的。

不论在美国和欧洲，不断评估和更新折点已得到了微生物学家、临床医生和监管机构的普遍认同。

例如，2007年通过的美国食品和药物管理法修正案（FDAAA）规定FDA更新折点，并且美国FDA已经在2009年作出回应，为行业印发指导文件，以在系统性抗菌药物产品和药敏试验设备中更新药敏试验信息标记。

M100-S20修订后的折点能更好地反映抗菌药物在以目前推荐方案治疗由菌株引起的感染时的真实疗效。

对产ESBL菌株的研究结果发挥了重大作用。

最初CLSI推荐进行ESBLs筛选及确证测试，并规定对于产ESBL的菌株，将青霉素，头孢菌素和氨曲南的药敏结果由敏感改为耐药，这条规定基于以下几点：

1）研究观察到某些产ESBL菌株，以上药物的MIC有升高但仍然在敏感区间（使用旧的折点）；

2）有限的临床观察发现，对于产ESBL菌株引起的感染，病人预后较差。

ESBL试验建议是处理一个新型耐药机制的短期解决方案。

随后，更多的耐药机制被发现（例如，新型的ESBLs和AmpC酶），并且越来越多的菌株被发现产多种酶导致ESBL的检测更加复杂。

以上事实以及人们对头孢菌素类和单环内酰胺类的PK-PD因素对治疗效果决定作用的认识导致折点的变更。

折点修订后，ESBLs筛选和确证试验将不再是决定治疗策略所必需。

当菌株产多种酶时（如当菌株同时产ESBLs和AmpC酶时将导致假阴性的结果）ESBL表型检测和确证试验的准确性将降低，而在当前，产多种酶的菌株已非常普遍。

菌株的MIC与临床预后的相关性强于菌株携带的耐药机制。

CLSI认为，新的折点将为病人治疗提供更合理的信息并降低临床实验室工作的不确定度和工作量。

新折点与旧折点的比较对于肠杆菌科菌，头孢菌素和氨曲南的折点修订如下（作为比较，也列出旧的折点）：

表2.M100-S20MIC折点更新（g/ml）:

抗菌药物旧（M100-S19）新（M100-S20）敏感中介耐药敏感中介耐药头孢唑啉81632124头孢噻肟816-3264124头孢唑肟816-3264124头孢曲松816-3264124头孢他啶816324816氨曲南816324816表3.M100-S20纸片扩散法折点更新（mm）:

抗菌药物旧（M100-S19）新（M100-S20）敏感中介耐药敏感中介耐药头孢唑啉1815-1714NANANA头孢噻肟2315-22141623-2522头孢唑肟2015-19142522-2421头孢曲松2114-20132320-2219头孢他啶1815-17142118-2017氨曲南2216-21152118-2017NA=未确定与头孢唑啉修订后MIC折点相关的抑菌圈直径折点尚未确立。

初步的研究并没有确立明确的抑菌圈直径折点，并且头孢唑啉的纸片扩散法试验可能需要使用一种改变含药剂量的新型纸片。

另外，以下药物对肠杆菌科菌的折点也被重新评估但没有被修改（这些药物的纸片扩散法折点也没有被修改）：

表4.M100-S20MIC折点（g/ml）抗菌药物旧（M100-S19）新（M100-S20）敏感中介耐药敏感中介耐药头孢呋辛（肠外）8163281632头孢吡肟8163281632头孢替坦163264163264头孢西丁8163281632头孢西丁折点不修改是因为当前数据支持现有的折点。

PK-PD评估表明，推荐的药物剂量在目标范围内。

头孢替坦的折点未改变是因为没有足够的数据支持。

头霉素类不被ESBLs水解并且头霉素的敏感结果不会由于ESBLs的确证试验阳性而改为耐药。

头孢吡肟折点没有修改是基于临床试验数据和PK-PD评估。

临床试验证实了对于产ESBL但头孢吡肟敏感（MIC8g/ml）的菌株感染的病人，头孢吡肟