细胞融合操作规程1文档格式.docx
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在100mL含15%血清的1640完全培养液中加入2mL50的HAT溶液(使用前HAT有部分白色沉淀应充分混匀),摇匀,4冰箱保存备用。
GNK溶液:
准确称取KCL0.4g,NaCL8g,Na2HPO42H2O1.77g(Na2HPO412H2O3.56g),NaH2PO4H2O0.69g(NaH2PO42H2O0.78g),酚红0.01g,葡萄糖2g,加DDW定容至1000mL,调节pH值至7.2,115高压灭菌,4保存备用。
三、实验步骤1.免疫小鼠选择6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行免疫,免疫剂量50g/只,皮下注射。
免疫程序如下:
首次免疫:
100L抗原+100L弗氏完全佐剂/只加强免疫:
100L抗原+100L弗氏不完全佐剂/只,于首免后2周后进行。
共免疫3次,每次间隔2周。
第二次免疫后的第十天断尾采血(一般尾部采血4L,溶于200LPBS混匀备用)检测效价,如果效价很低或没有效价,建议直接放弃,不用继续再免疫。
如果效价可以,在二免后的2周进行三免,最后一次免疫10天后,断尾采血,用适当的抗原进行包被,用间接ELISA检测抗体效价,效价达到1:
1600以上即可进行细胞融合。
超强免疫:
最后一次加强免疫后2周,细胞融合前35天,尾静脉或腹腔注射50g纯抗原。
2.饲养细胞的制备融合前1-2d制备饲养细胞。
取昆明鼠1只致死(收集小鼠血清,以供筛选时用该血清做阴性对照),75%酒精消毒体表,无菌手术剪刀轻轻剥去小鼠的腹部皮肤,以防止剪破腹膜,暴露腹膜。
然后用5mL注射器和16号针头将5mL预冷的HAT打入小鼠腹腔,轻轻压挤腹部,重新吸出注入的液体(在吸取过程中为防止污染,避免针头刺破肠管),收取小鼠腹腔巨噬细胞。
用HAT稀释至40ml,100uL/孔添加到4块96孔细胞培养板中,置375%CO2培养箱中培养,第二天检查有无污染情况。
3.细胞计数为保证NS0细胞在融合时达到最佳状态和高活力,建议在融合时前一天给所需的每瓶NS0细胞换液,以备融合时使用。
80%左右NS0的细胞计数(三次平均数):
(11.6105+9105+3.7105)/3=8.1105/mL脾细胞计数6.5106/mL,大约是40mL有2.6108个细胞,两次计数相差不大,所以脾细胞数可固定为2.6108个/40mL。
NS0细胞计数:
3.7105个/mL(70%)9105个/mL(80%)11.6105个/mL(90%)脾细胞计数:
4.细胞融合在40水浴中预热GNK溶液、PEG和HAT溶液;
免疫小鼠采血并分离血清,然后致死浸泡到酒精中;
收集NS0细胞于50mL离心管中(为保证高融合率建议大于4瓶90%的NS0细胞),1000r/min离心10min,弃上清,用GNK洗一次;
5小鼠脾细胞的制备依次剪开小鼠皮肤,腹膜暴露腹腔(建议为防止污染,建议至少用两套手术刀具,一套用于剥开小鼠外部皮肤和腹膜,另一套用于取出小鼠脾脏),取脾脏放置与尼龙纱布上充分研碎,并用GNK洗下去,收集脾细胞于50mL离心管中,1000r/min离心10min,弃上清,打散细胞团;
将脾细胞与NS0骨髓瘤细胞混合于50mL离心管中,加GNK溶液至40mL,1000r/min离心10min,弃上清,打散细胞团(充分打散细胞团,以保证融合时的高融合率);
为保证融合时的温度可以事先将混匀好的细胞在40水浴预热两分钟,然后在另一刚取出的40水浴烧杯中做融合,用1mL或大于1mL吸管将预热的50%PEG(pH8.0)滴加到融合管中,边加边轻轻摇动融合管,1min或80s内加完,并继续在水浴中缓缓摇动融合管1.5min。
立即缓慢滴加37预热的GNK溶液15mL。
加入步骤为:
1mL/30s,3mL/30s,11mL/30s。
然后慢慢补加GNK溶液至40mL,37水浴静置5min,1000r/min离心10min,弃上清。
打散细胞团,加40mLHAT完全培养具吹打混匀,加到含饲养细胞的96孔细胞培养板上,每孔100L,置375%CO2培养箱中培养。
克隆细胞的筛选、转孔及亚克隆一、融合细胞的培养1、融合后的细胞置于CO2培养箱中培养,次日检查有无污染,如发现污染立即滴加1%的NaOH。
2、一般23d可见小克隆;
7d时于出现克隆的孔内半量换液(注意:
37预热HAT培养基);
3、10d左右可以吸取少量上清用于筛选(一般吸取50100L),并补加等量的HAT培养基(换液时应轻柔,以减少对克隆细胞的损伤);
4、14d左右对所筛选的阳性孔可半量更换HT培养基,同时对筛选阳性孔的细胞转至24孔培养板中扩大培养,准备克隆化。
在筛选过程中将HAT培养基逐渐更换为完全培养基RPMI1640/10。
二、筛选
(1)包被。
将抗原以pH9.6的NaCO3-NaHCO3包被,每块酶标板以5-20ug抗原为宜(如果抗原为多肽或小分子物质,则需要加大包被量,如果是纯化病毒根据病毒的浓度做1:
400-1000倍稀释)。
每孔的包被体积为50ul。
37包被2h或4包被过夜。
(2)封闭。
倒掉抗原,拍干酶标板孔内液体,5%脱脂牛奶(PBST溶解)或其它无关物种血清于37封闭2h,封闭完后可立即使用,也可以洗涤一次置于4密封保存以备后面使用。
(3)一抗。
封闭完后,弃去孔内液体,拍干,用封闭液1:
1稀释待检测克隆孔上清,每孔50ul为宜。
同时做阳性(融合小鼠血清1:
500-1000倍稀释)和阴性(所制备饲养细胞小鼠血清1:
200倍稀释)及空白对照(所稀释抗体用封闭液)和无克隆孔上清对照。
在每块板子上做好标记。
37孵育30min。
(4)二抗。
孵育完一抗后,弃去孔内液体,拍干,以PBST洗涤3次,每次5min。
根据二抗说明稀释二抗至适当比例,每孔加入50ul,37孵育30min。
(5)显色。
孵育完二抗后,弃去孔内液体,拍干,加入显色剂,37显色5-10min,拍照记录检测结果,筛选出阳性较强的克隆进行特异性检测。
三、特异性筛选对筛选的强阳性克隆孔进行特异性筛选,如果是用大肠杆菌表达的蛋白,可以用载体蛋白、正常大肠杆菌上清以及其它无关蛋白进行包板检测;
如果是细胞毒免疫的可以用正常细胞的裂解液包板检测;
如果是组织毒免疫的可以用正常动物组织包板检测。
其检测方法同上,注意设立对照组。
同时对筛选的特异性较强的阳性孔转至24孔培养板中扩大培养,准备克隆化。
四、阳性细胞的转孔1、为保证转孔成功,建议当96孔板细胞长至80%时转孔。
2、按常规方法转孔前一天制备饲养细胞,24孔板每孔加入0.5-1ml的饲养细胞悬液,第二天检查有无污染情况。
(转孔时所用培养基和转孔前所用培养基应保持一致)。
3、收集待转孔的阳性细胞上清,做好标记保存备用,添加已预热的HAT和HT培养基1:
1混合(因此时96孔板克隆已半量过度到HT培养基)各100ul/孔。
4、用200ul移液器轻轻吹下细胞,为减少对克隆细胞的刺激,吹打过程应轻柔,然后将细胞悬液加入至24孔板中,为保证细胞均匀分布到板底,可以用振荡器轻轻混匀,做好标记。
同时,对所转孔细胞补加新的培养基,保留原始孔以避免转孔失败。
五、转孔后的检测当转孔后细胞长至50%时,用ELISA检测方法及时进行效价检测和特异性检测,检测方法同上,筛选出效价高和特异性较强的准备亚克隆。
同时在筛选过程中对24孔板的细胞逐步更换至1640完全培养基。
六、杂交瘤细胞的克隆为保证克隆细胞的活性和数量,建议当待克隆的细胞孔长至80%时进行有限稀释。
提前一天制备饲养细胞,收集待转孔细胞的培养上清保存备用,加入已预热1640不完全培养基1ml(其目的是该孔细胞被有限稀释后可以冻存该孔细胞。
冻存方法为:
直接吸取500ul该孔细胞悬液,再加入400ul胎牛血清和100ulDMSO混匀,1ml/管,做好标记,按照正常程序冻存细胞),轻轻吹打混匀细胞,取出少许细胞悬液进行计数,采用有限稀释法对阳性孔的融合细胞进行克隆化。
其步骤如下:
1、用10ul台盼蓝和10ul细胞悬液于PCR管中等比例混合后,在显微镜下进行活细胞计数根据公式:
细胞数/mL=N/410310稀释倍数(N为显微镜下四角4个大方格的活细胞总数)来计算每毫升细胞悬液所含的活细胞数,然后取适量的细胞悬液,用1640培养基(此时24孔板克隆细胞过度到那种培养基就用那种培养基做有限稀释)稀释到10mL,并且要含有2103个活细胞(稀释度);
2、取1mL稀释度的细胞悬液加9mL1640完全培养基(稀释度);
3、取3mL稀释度的细胞悬液加7mL1640完全培养基(稀释度);
4、用稀释度的细胞悬液铺板半块96孔板,100L/孔,20个细胞/孔;
用稀释度的细胞悬液铺板另半块96孔板,100L/孔,2个细胞/孔;
用稀释度的细胞悬液铺一块96孔板,100L/孔,0.6个细胞/孔;
5、将上述培养板置于CO2培养箱中培养,培养7d后,对单克隆孔进行标记并半量换液,当单克隆长至孔底的1/10时,进行效价检测和特异性检测,筛选出特异性较高和阳性较强的细胞进行重复克隆;
6、同时每次将克隆剩余细胞转入24孔细胞培养板培养(并在原孔中补加另一批培养基,以防二者同时污染或细胞死亡),继而转入6孔板或细胞中进行扩大培养,并及时冻存;
经过多次克隆操作,直至所有克隆的细胞孔检测阳性率为100%时,即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后,及时进行扩大培养并冻存。
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- 细胞融合 操作规程