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PCR检验.docx
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PCR检验
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。
因此,无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。
这也是“微量证据”的威力之所在。
由1983年美国Mullis首先提出设想,1985年由其发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,意味着PCR技术的真正诞生。
到如今2013年,PCR已发展到第三代技术。
1973年,台籍科学家钱嘉韵,发现了稳定的Taq DNA聚合酶,为PCR技术发展也做出了基础性贡献。
PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
荧光定量PCR技术检测的报告形式
一,拷贝数的意义:
表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量
二,拷贝数与病原体的关系:
拷贝数与病原体的数量成正相关
三,报告形式:
1如果标本量是可以定量的,如血液等,则检测结果报告为:
IU/ml(可溯源到国际标准物质的标准品)
如HBV-DNA:
检测下限:
100IU/毫升即:
<1.00E+02IU/ml
如果标本不能定量,如痰液,分泌物等,则结果只能报:
copies/毎测试
荧光定量PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知的起始模板进行定量分析的方法。
Ct值得意义
扩增越靠后定量的重复性就越差
--扩增末期,扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响,偏离线性
--在Ct值处重复性非常好
--荧光定量技术要求在低浓度进行
荧光定量PCR在临床中的应用
一,感染性疾病
1,肝炎病毒定量检测
2,结核杆菌及呼吸道病原体检测
3,优生优育(TORCH)相关项目检测
4,性病病原体检测
5,手足口病相关病毒EV71,柯萨奇病毒的检测
二,肿瘤个体化诊断与治疗
三,遗传性疾病
四,疾病风险评估
乙型肝炎病毒(HepatitisB)
HBV基因分型与CHB(临床遗传性疾病)的关系
全基因组测序HBV可分为A.B.C.D.E.F.G.H8个基因型
HBV基因型--HBV基因型与病毒复制及病毒标志物表达的关系
--HBV基因型临床疾病谱及疾病预后的关系
--HBV基因型与抗病毒疗效之间有关系
血清学指标(-)不能排除HBV感染
HBeAg(-)/HBV-DNA(+)
编码e抗原的preC区基因极易出现变异,在preC区出现终止密码子,在preC区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原。
导致HBeAg表达缺失,机体感染HBV不表达HBeAg,当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。
HBV基因型---HBV基因型临床疾病谱及疾病预后的关系
--HBV基因型是影响慢性乙型肝炎的临床转归的主要决定因素之一。
--HBV感染的临床转归一方面决定于患者的年龄和免疫能力,另一方面与基因型种类密切相关。
在B,C为优势地区,C型具有较强的疾病能力,预后差;在以A,D为优势的地区,D型具有较强的致病性,肝病严重,预后不良;基因型C在乙肝后肝硬化的发病中起一定的作用,然而基因型B与年轻无肝硬化患者肝癌的发生有关。
HBV基因型与抗病毒疗效之间有关系
--干扰素抗病毒疗效与HBV基因型有一定的相关性,基因C和D对干扰素的治疗反应比基因型A和B要差
(HBV基因型与病毒复制与清除。
病毒变异.临床表现.治疗应答和预后均有关系,提示不同基因型具有不的致病性)
HBVDNA与疾病的诊断
HBVDNA与乙肝”两对半“
---”两对半”:
机体的免疫反应状态,为间接指标
----HBVDNA是乙肝病毒的遗传物质,是病毒存在和复制的最可靠,最直接的指标。
----“携带者”,“大三阳”,“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。
“大三阳”与HBV-DNA:
“HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)”提示患者体内HBV-DNA呈活动性复制,传染性强,荧光定量PCR方法检测HBV-DNA阳性检出率大于80-90%,且病毒载量>10的六次方IU/ml
“小三阳”与HBV-DNA:
“HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)”,HBV-DNA阳性率为40-80%左右,且病毒载量<10的六次方IU/ml。
一般情况下
HBeAb(+)表明HBV复制处于较低水平并可能和宿主DNA发生整合,导致含量较低,应进行HBV-DNA定量检测。
常规结核病实验室诊断方法及不足
--细胞培养“金标准”,周期长
--痰涂片作抗酸染色:
灵敏度差,检出率《30%。
特异性差,无法将结核杆菌和其他分枝杆菌区分开
--血清学诊断:
交叉反应,假阳性
FQ-PCR诊断结核的关键点
--痰液,肺及支气管灌洗液--肺结核
--血液-播散性结核和各脏器的结核病
--脑脊液-中枢神经系统结核病
--宫颈拭子,尿道拭子-泌尿生殖系统结核病
--胸水-结核性胸膜炎
--腹水-结核性腹膜炎
HCV的基因型/亚型{6个型,68个亚型}
-1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m
-2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m
-3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,
-4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t
-5a
-6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n
中国亚型1b(66%),2a(14%),对抗病毒治疗应答不同,因此治疗方案不同。
HCV的基因耐药突变
特异基因靶向治疗(小分子抑制物)中靶点编码区的耐药
--HCV蛋白酶(NS3-4A)
--RNV酶(NS5b)
HCV的基因型与药物治疗
--现知欧美国家多数HCV-1型感染,而亚洲国家以2型为主,三型次之
--三型感染临床症状较重,有引起严重肝病的倾向
--1b型感染对干扰素治疗不敏感,效果差,2a型感染用干扰素治疗效果好。
HCVRNA定量的临床意义
TORCH感染特点
--母婴传播的主要病原体
--引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因
--自然状态下呈隐性感染
--怀孕,多次输血,AIDS等易发生显性感染
--可致多发性,全身性感染
--只有风疹可获得长久的免疫力,可用疫苗预防
TORCH相关病原体检测
-弓形虫(TOX)
-风疹病毒(RV)
-人巨细胞病毒(HCMV)
-单纯疱疹病毒(HSV-2)
基因检测与预测医学
基因检测使预测医学称为可能。
疾病分险基因,易感基因的检测,不同人群差异基因的检测,可以全面评估个体对相关疾病的患病风险,从而预测疾病的发生,早期干预,预防。
结核杆菌与呼吸道病原体检测
--结核杆菌(TB)
--EB病毒(EBV)
--肺炎衣原体(CP)
--肺炎支原体(MP)
常见性传播病原体检测
-淋球菌(NGH)
-沙眼衣原体(CT)
-解脲支原体(UU)
-梅毒螺旋体(TP)
-单纯疱疹病毒(HSV)
-乳头瘤病毒(HPV)
-人类免疫缺陷病毒(HIV)
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