第4章培养基灭菌与除菌Word文件下载.docx

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a.菌体的增殖速度有关b.与菌体细胞膜的合成有关，从而影响到细胞膜的通透性c.对于某些菌体，与代谢途径和代谢机制有关。

（4）生长因子：

大多数菌体的生长因子如下：

a.维生素：

大多数维生素是微生物生长的辅酶，需要量很小，150g/L。

b.AA，凡是微生物自身不能合成的AA则必须以游离的AA或者小分子的肽提供，通常，以小分子的肽提供，微生物更易通过细胞膜进入菌体内部?

，如果提供外援氨基酸，需要注意的是各种氨基酸的平衡。

c.嘌呤及其衍生物2.培养基的优化方法一种合成培养基的设计，需要考虑的因素是很多的，需要研究的成分也是很复杂的，其中包括碳源、氮源、玉米浆等，即便是碳源还可以是几种碳源的混合体，再加上述几种因素之间的相互影响，要确定一个科学的培养基配方是需要做大量的工作的，采用一个合理的数学方法，就可以在减少工作量的前提下，得到科学的结果。

介绍一种数学方法：

均匀实验设计方法旋转正交实验方法.这是在正交实验的基础上发展起来的一种对于多因素、多水平的一种实验设计方法。

参考文献：

方开泰:

均匀正交实验方法雄宗贵:

发酵工艺学原理4-2培养基用材料及处理发酵培养基用原料是非常广泛的，许多原材料需要经过处理后方能够使用，特别是以淀粉质为原料的发酵工业，大多数的情况下需要将淀粉进行水解处理。

本节内容：

starch的水解；

糖蜜的预处理；

工业用添加剂一、淀粉的水解许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使Glucose等单糖，主要有下列菌种：

酵母：

G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等大部分的细菌：

GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等其中：

地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。

霉菌：

大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。

淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法，分别介绍如下：

1.淀粉的水解方法

（1）淀粉的酸法水解水解原理：

淀粉是由葡萄糖通过-1，4或-1，6葡萄糖苷健连接而成的含有多个葡萄糖的大分子长链物质，根据其葡萄糖连接的糖苷健的不同，可分为枝链淀粉和直练淀粉，可以使用重合度来表示淀粉分子的大小，所含有的葡萄糖苷健的数量，称之为淀粉的重合度，用DP来表示。

淀粉内部的葡萄糖苷健在一定的温度和酸性的条件下可以水解，而使淀粉分子链断裂，高温可加速葡萄糖苷健的水解速度。

水解条件：

高温，120以上，H+,0.2MPa的压力缺点：

反应条件比较强烈，产生的副产物较多.主要有下列副产物：

a.双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖，前者不利于产物的结晶提出，后者对于菌体的生长有抑制作用。

b.一分子葡萄糖脱水，形成5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。

c.一分子葡萄糖和NH2反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。

（美拉得反应）2.酸酶法3.酶酸法4.双酶法：

使用两种淀粉水解酶：

-淀粉酶淀粉-1，4；

1，6葡萄糖苷酶。

-淀粉酶：

又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉-1，4葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，液化的含义？

其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖（从水解葡萄糖苷健的种类，水解速度到最后已无工业意义三个方面），因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。

淀粉-1，4；

1，6葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉分子的-1，4；

或-1，6葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。

酸法与双酶法的优缺点比较：

（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。

有的人会问？

目前采用的耐高温-淀粉酶的作用温度也是较高，突破100，和酸法水解的温度相差不多。

双酶法淀粉水解首先使用耐高-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。

（2）正因为上述原因，淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高10%以上。

这可以给味精、制药的领域带来巨大的经济效益。

对于年产10000吨的小型味精厂，年增产100吨味精，直接经济效益可达到：

0.8*100=80万元。

（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。

（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到20Be以上，而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有12Be，原因？

（副产物）意义？

（设备利用率）介绍液体浓度Be的概念：

波美度（Be）是表示液体浓度（比重）的一种方法，其和液体比重之间有下列关系：

d=/-Be式中d：

液体的比重：

模数因标定的温度不同可将波美表分为：

美国：

15.6标定，=145合理：

15标定，=144.3荷兰：

12.5标定，=144标定方法：

轻表：

“0”Be的位置，把表放在一定温度下的蒸馏水中的位置；

“10”Be的位置，把表放在一定温度下的比重为0.9351的溶液中的位置。

重表：

“0”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的蒸馏水中；

“66”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的比重为1.842的浓硫酸溶液中。

表示溶液的比重的方法还可以使用Bx（玻利克斯）：

定义：

某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。

注意：

Bx的概念不同于波美度，他与比重之间是没有计算公式的，但是可以查找有关换算关系。

2.淀粉的双酶法水解工艺淀粉调浆液化糖化过滤糖液浆液浓度：

2030Be,调pH值6.07.0，添加CaCL2,使用量，0.01mol/L（目的？

）液化：

耐高温-淀粉酶，酶的使用量：

58单位/g淀粉温度：

105；

时间，2030分钟降温：

采用喷射冷却方法：

糖化：

使用淀粉-1，4；

1，6葡萄糖苷酶；

使用量：

根据液化淀粉的浓度，30%的浓度，80100单位/g淀粉温度：

65终点判断：

时间，23小时。

二、糖蜜的处理1.糖蜜的主要成分

（1）糖，4950%，因不同的原料和生产方法不同而异，主要是蔗糖

（2）胶体物质，510%，来自于原料（3）灰分，1012%（4）生物素，110mg/Kg（甘蔗），0.040.06mg/Kg（甜菜）（5）pH值6.2（甘蔗），7.4（甜菜）对于发酵工业可以利用得的主要成分是：

糖和生物素2.用途

（1）发酵工业用原料，国内发酵生产的有：

味精、酵母目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染，

（2）使用糖蜜生产酒精（3）使用糖蜜生产蒸馏酒姥姆酒，世界名酒，牙买加的国酒，在西方国家主要用于鸡尾酒的勾兑上。

（4）作为添加剂使用，柠檬酸发酵，作为添加剂使用。

（5）使用糖蜜发酵生产黄源胶，已有研究报道。

3.处理方法处理目的：

a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性，有利于改善发酵过程中氧的传递。

b.脱色，除去有色物质（有色物质的来源？

），对产品的质量有影响，对微生物的生长和代谢有影响。

c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对pH值有影响的缓冲性物质。

方法：

a.冷酸通风沉淀法，即加酸后，通风，使之沉淀糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风的目的是除去一些挥发性物质。

（教材中提到的通风是为了提高KLa是错误的）b.加絮凝剂（PAM）聚丙烯酰胺（PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于糖蜜的澄清。

工艺过程：

原溶液（稀释）40Bx调pH值（33.8）絮凝静置絮凝剂的用量：

8mg/L，静置时间：

1小时加热到90C.活性炭吸附法可以除去糖蜜中的有色物质，明显的降低糖蜜的色泽，对发酵的产品的提出和产品质量有益。

缺点：

活性炭的使用量较大，处理成本较高。

三、工业培养基的添加剂添加剂通常是指除了培养基中的C、N、无机盐、金属离子以外的其它物质，主要有：

1.前驱物质特别是对于某些氨基酸、核苷酸和抗菌素的发酵生产，添加一定量的前驱物质（前体）其作用是非常明显的。

基本原理：

（1）S前驱物质产物反馈抑制的存在，需要添加前驱物质不存在抑制或阻遏

（2）S前驱物质的和成效很低，需要添加前驱物质（3）SX前驱物质产物存在分枝代谢，不能够很好的解决分枝代谢对X的反馈抑制作用，须要有添加剂注意：

前驱物质的使用，因不同的菌种、不同的产物、不同的代谢机制而使用的方法不同，使用的浓度也不同，但都是建立在对其代谢调节机制有从分的了解的基础上的。

2.代谢促进剂和代谢抑制剂促进剂主要是指诱导物，在酶的生产；

抑制剂主要在抗菌素的生产中使用的较多。

（1）四环素发酵过程中，添加NaBr,可以抑制金霉素的生物合成，从而提高四环素的产率。

（2）头孢霉素C，添加LMet，可以抑制头孢霉素N的生物合成，从而提高头孢霉素C的产率。

上述这些情况，抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链具有分枝代谢上的，如下图所示：

SABC产物副产物（X）抑制剂作用点，通常是X的结构类似物4-3培养基的灭菌一、灭菌原理所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，这一概念不同于消毒。

后者是指消灭一切致病微生物（病原体）灭菌的方法很多，在实验室可以使用干热灭菌、对于环境可以使用化学试剂灭菌，但化学试剂的灭菌方法有很大的限制。

在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌？

湿热灭菌的显著优点是：

使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。

下述内容就是针对湿热灭菌的。

首先讨论几个基本概念：

1.微生物的热阻定义：

微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。

其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。

相对热阻：

两种微生物的热阻之比。

芽孢/大肠杆菌=3000000/1；

病毒/大肠杆菌=15/1等2.理论灭菌时间微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。

因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程：

-dN/dt=k*N式中-dN/dt：

表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率N：

表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数K：

表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数，K=f（灭菌温度、菌种、培养基等）上式的积分形式为：

t=2.303/k*lnN0/NS式中N0，NS：

分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）k：

意义同上t：

表示理论灭菌时间理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题：

（1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻越大，K值也越大。

芽孢，在121时，K=60/s营养体，在121，k=606*1010/s

（2）在计算过程中，N0，NS如何取值？

N0=芽孢性细菌总数+芽孢数灭菌时温度升高，营养体即可变成芽孢对于NS，如果取NS=0，那么，t=，这显然是与现实情况不符。

对于如何NS取值？

通常取NS=10-3，这个数值如何理解？

灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。

这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。

（3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，因此在实际生产中，通常采用经验数值：

间歇灭菌，121，2030分钟连续灭菌，137，1530s，在维持罐中保温820分钟。

3.灭菌温度的选择灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：

a.微生物的热致死温度，应高于该温度。

通常以芽孢为准。

何为热致死温度？

（10分钟，全部死亡的温度）b.营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。

许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度：

dc/dt=-K，C式中dc/dt：

表示营养成分破环的速率，C：

表示营养成分的浓度K，：

为反应速度常数，1/s，K=f（t,）反应速度常数K，与温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之：

K，=A，e-E/RT

（1）式中K，：

反应速度常数，1/SE,：

反应的活化能（J/mol）R：

气体常数，1.987*4.18J/mol*kT：

反应的绝对温度，k同样，灭菌过程中的反应速度常数也可以用下式表示出：

K=Aexp-E/RT

（2）

（1）、

（2）式可以改写成下列形式：

lg（k,2/k,1）=E,/R（1/T1T2）（3）lg（k2/k1）=E/R（1/T1T2）（4）（3）（4）的意义是指：

反应的温度从T1升高到T2，其反应的速度常数分别从k,1增加到k,2；

k1增加到k2；

培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，如下所示：

BAC对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：

lg（k2/k1）/lg（k,2/k,1）=E/E,（5）实验证明：

营养成分为破坏的反应的活化能E的值为E,=8.3683.6*103J/mol而菌体死亡的活化能E芽孢：

E=418*103J/mol无芽孢：

E=209250*103J/mol显然，（5）式的比值1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。

提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。

换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。

通常所说的高温短时灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。

但是高温短时灭菌是需要一定的设备条件的，通常需要连续化的灭菌工艺流程？

（高温后的快速冷却在大型的生物反应器内是很难实现的）这就给中小型生产企业带来了一定的困难，设备投资的增加，技术管理水平的提高（培养基连续灭菌后，后述设备的无菌化管理对于整个体系的无菌操作是必需的）高温短时灭菌的优点还可以表现在：

节省能量上，培养基的预热？

二、培养基的工业灭菌方法培养基的工业灭菌通常涉及到以下几个概念：

1.空消:

意义：

由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。

采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。

2.实消：

定义？

优点：

不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。

3.连消：

营养成分破坏少，生产效率高热综合利用率高大型企业自动化程度高尽管，高温短时灭菌的优点非常明显，但不能说发酵领域采用高温短时灭菌是唯一的选择。

一个生产企业灭菌方法的选择是要从生产工艺、设备、操作、技术管理、固定资产投资等多个方面整体考虑。

目前，我国发酵领域仍然是以分批操作的实消为主，因此我们的后述内容主要是介绍分批操作的实消灭菌工艺。

三、分批灭菌操作要点将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下：

1.定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：

冷却管道，夹套。

2.培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气？

当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道出于两个状态：

进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。

讲一下，阀门的特殊性？

3.培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到100时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到100时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。

4.注意辅助设备的灭菌：

空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。

5.保温期间，要求罐压：

0.090.10MPa，温度：

118121，时间：

30分钟。

6.灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。

7.配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。

四、分批灭菌的工程计算主要介绍一下传热计算（与毕业设计教学环节有关，与将来的实际工作关系更大）。

1.升温阶段培养基在反应器内的升温有两种加热方式：

（1）使用夹套、冷却排管

（2）蒸汽直接加热

（1）使用夹套、冷却排管t=W*C/K*Fln（t1t2s）/（t1t2f）式中t：

升温所需要的时间（小时）W：

培养基的重量，（Kg）F：

总的传热面积，m2t1：

加热蒸汽的温度，t2s：

培养基加热的起始温度，t2f：

培养基灭菌的温度，k：

平均传热系数，KJ/m2*hr*因为在加热过程中，培养基的温度在不断升温，温差在变化，属于不稳定传热过程，其传热系数k，应取平均值：

夹套加热：

k=8301254KJ/m2*hr*排管加热：

k=12541881KJ/m2*hr*C：

培养基的比热，KJ/Kg*比热C的计算方法：

采用线性叠加法：

C=0.374.18*X+4.18（1-X）醪液中固形物的重量百分数%0.374.18：

固形物的比热，KJ/Kg*任何以谷物、淀粉为原料的醪液，其比热都可以这样计算。

（2）蒸汽直接加热加热的速度很快，时间不需要计算，需要计算的是蒸汽的消耗量：

S=W*C（t2ft2s）+Q1/（t2f）式中S：

蒸汽的消耗量，KgQ1：

发酵罐散失的热量，Q1=Q总（1020）%：

蒸汽的热含，KJ/kg（与蒸汽的压力有关）t2f、t2s：

与上述相同2.保温阶段此时，打开发酵罐顶部的所有排气阀门，排蒸汽灭菌：

蒸汽的消耗量S计算如下：

S=1.19FT（P/）0.5式中S：

蒸汽的消耗量，KgF：

蒸汽排出口总面积，cm2T：

排气的时间，分钟P：

罐内绝对压力，MPa：

蒸汽的比容，m3/kg3.冷却阶段需要计算的是冷却的时间，尽可能快的降温，减少培养基营养成分的损失。

T=W*C1/G*C2（A/1-A）ln（t1st2s/t1ft2s）式中W、C1：

分别表示培养基的重量和比热，Kg、KJ/Kg*G、C2：

分别表示冷却水的流量和比热，Kg/hr、KJ/Kg*t1s：

培养基开始冷却的温度，即灭菌温度，t1f：

培养基需要冷却到的温度，即接种的温度，t2S：

冷却水进口的温度，A=expKF/GC2（t1t2s/t1t2）式中G、C2：

分别表示冷却水的流量和比热，Kg/hr、KJ/Kg*F、K：

意义同前t2S：

冷却水进口的温度，t1：

被冷却介质的任何一个温度，t2：

与被冷却介质温度t1相对应的冷却水的出口温度，思考题：

1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？

2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？

3.淀粉的水解方法主要有什么？

试进行有缺点比较？

4.双酶法淀粉的水解通常使用哪2种酶？

其作用特点分别是什么？

5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？

灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。

6.生物反应器灭菌的操作要点有什么，绘图说明操作过程。

7以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。

8掌握以下几个概念：

理论灭菌时间、对数残留定律、实消、空消、连消