心胆论治针灸抗动脉粥样硬化斑块的临床与分子机制研究Word文档下载推荐.docx

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1.1.2造模:

本研究运用的血栓模型主要有

（1）建立体外模拟体内四维室腔小鼠血栓的模型:

将全血或富含血小板血浆中均匀加入到被诱聚剂ADP、花生四烯酸、胶原等铺盖的长方体玻璃室腔,通过诱聚剂刺激血小板上相应的受体,在体外诱导血小板黏附和聚集,并对其进行评价。

可以反映血小板总体功能状态,并可以直接用于评价处理前后血小板黏附与聚集功能变化,分析血小板数量、黏附和聚集所需时间及形态改变。

（2）建立体内显微摄影血栓模型:

先将小鼠麻醉,进行气管插管以及颈静脉插管。

利用激光损伤小鼠提睾肌小动脉,荧光标记的血小板在不断递增的血栓中黏附和聚集。

分析不同基因型小鼠,或重组载脂蛋白A-IV处理前后的小鼠血栓形成的速率,大小和组分等的差异。

（3）建立高脂饮食后的小鼠血小板功能评价模型:

将C57BL/6J野生型,载脂蛋白A-IV过表达转基因（apoA-IV-Tg）,载脂蛋白A-IV基因敲除（apoA-IV-/-）,载脂蛋白A-IV野生型（apoA-IV+/+）和杂合子（apoA-IV+/-）小鼠在禁食12小时候后进行3小时高脂饮食（HFD）。

在禁食及高脂饮食后分别收集这几类小鼠的血液,凝胶过滤血小板,并进行血小板功能测定。

1.1.3其他体外实验:

包括表达与纯化人和鼠的重组载脂蛋白A-IV,及生物素标记的重组载脂蛋白A-IV;

运用流式细胞技术检测血小板活化及血小板表面不同黏附分子;

运用ELISA、流式细胞技术法、免疫荧光分析血小板的活化、炎症反应;

运用体积排阻色谱,圆二色极谱仪和热变性测定评价重组蛋白及重组突变蛋白的二级结构及其稳定性;

利用血小板聚集仪,通过分析重组载脂蛋白A-IV处理前后或不同基因型血小板玻璃管中光的通透性变化以评价血小板聚集功能改变。

1.2人体实验研究1.2.1研究对象:

健康人群1.2.2

（1）建立体外模拟体内四维室腔人血栓的模型:

造模方式同四维室腔小鼠血栓的模型的建立。

（2）探讨人载脂蛋白A-IV水平和血小板聚集相关性的临床研究以及在人群中载脂蛋白A-IV的昼夜节律变化的研究:

从2017年1月至3月期间,在广东省中医院招募20位健康志愿者纳入这项研究。

一天中,于中午12点,傍晚6点,半夜24点以及清晨6点,取受试者（饭前）静脉血,并运用血小板聚集仪进行血小板聚集试验,以及运用酶联免疫吸附测定试验测量载脂蛋白A-IV的血浆水平。

2.“心胆论治”针灸抗动脉粥样硬化斑块的临床及机制研究本课题临床试验属于前瞻性真实世界研究（Real-WorldStudy）。

2.1研究对象2016年5月至2017年10月期间,在广东省中医院收集符合痰湿质颈动脉粥样硬化斑块纳入标准和排除标准的患者,其中针灸组23例,西药对照组9例;

以及健康人群6例。

2.2干预方案分为3组,“心胆论治”针灸组,西药对照组和健康人群组。

2.2.1“心胆论治”针灸组:

取穴为内关（双）、阳陵泉（双）、人迎（双）、心俞（双）、膈俞（双）、胆俞（双）,百会、印堂、引气归元（中脘,下脘,气海和关元）。

操作方法:

患者取仰卧位,术者手指及腧穴皮肤用0.5%碘伏消毒后,以三指持针快速进针,进针深度依穴位部位、体型胖瘦而定,先针内关（双）、阳陵泉（双）、人迎（双）,后针百会、印堂,行捻转手法至患者觉局部酸麻胀痛,每个穴位得气即止。

内关、阳陵泉、百会、印堂采用常规刺法刺入0.6-1.0cm。

针刺人迎穴时医者以押手扪及喉结外1.5cm,胸锁乳突肌前缘处颈总动脉搏动处,颈动脉轻轻拨向外侧并固定,避开颈动脉直刺0.5-0.8cm,以得气并可见针体随动脉搏动而摆动为度。

留针30分钟,配合导气法,嘱患者行鼻深呼吸。

医者出针后对分别对两侧人迎穴单独按压2分钟,同时患者嘱休息,若无不适感,嘱患者取仰卧位及俯卧位,采用精灸治疗。

精灸先后在引气归元、四花穴位皮肤局部涂增加粘附和防烫伤作用的万花油,然后将底径0.2mm×

高度0.2mm艾炷粘贴其上,自艾炷尖端用线香点燃艾炷,在艾炷燃烧过半,局部皮肤潮红、灼痛时移去艾炷,更换另一艾炷,每穴灸2壮。

精灸完用棉签拭去万花油。

接着进行埋皮内针,用0.5%碘伏在双侧心俞、胆俞穴皮肤消毒后,一手将俞穴部皮肤向两侧舒张,另一手持镊子夹持针尾平刺入俞穴皮内。

先在针尾下垫一橡皮膏,然后用脱敏胶布从针尾沿针身向刺入的方向覆盖、粘贴固定。

2.2.2西药组:

口服拜阿司匹林75mg/日,阿托伐他汀10mg/日。

2.2.3健康人群组:

治疗方案同针灸组。

2.2.4.疗程:

针刺,皮内针及艾灸每周治疗2次,两次治疗间隔时间≥72小时;

4周为1疗程,共治疗2个疗程。

西药对照组4周为1个疗程,共计2个疗程。

健康人群组针灸次数共2次。

2.3观察指标2.3.1主要观察指标:

（1）Intima-mediathickness（IMT）:

血管内膜与官腔交界面到中膜与外膜交界面的距离。

该指标常用来评价早期动脉粥样硬化的程度。

（2）斑块的总厚度即Crouse积分:

不考虑斑块的长度,分别将同侧颈动脉各个孤立性动脉粥样硬化斑块的最大厚度相加,得到该侧颈动脉的斑块积分,双侧求和为斑块总积分。

（3）斑块的面积（4）血浆载脂蛋白A-IV水平以及人群载脂蛋白A-IV昼夜节律水平（5）血小板聚集功能2.3.2次要观察指标:

（1）血脂四项即胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白,及脂蛋白（a）

（2）凝血四项:

凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、和纤维蛋白原（FIB）（3）全血血小板计数。

以上观察指标为针灸组和西药组的观察指标,健康人群组的观察指标仅为2.3.1.（4）血浆载脂蛋白A-IV水平以及人群载脂蛋白A-IV昼夜节律水平。

2.4观察周期在治疗前及治疗8周后进行评价（除健康人群组）。

健康人群组为针灸前后进行评价。

2.5统计方法采用Prism建立数据库并进行数据的管理与分析,分析方法主要是采用配对t检验（Paired,two-tailedStudent’st-test）。

结果:

1.载脂蛋白A-IV与血小板功能及血栓形成相互关系的基础研究1.1表达与纯化人和鼠的重组载脂蛋白A-IV,及生物素标记的重组载脂蛋白A-IV利用基因重组技术,在大肠杆菌中产生重组蛋白。

蛋白质电泳和蛋白质印记实验证明了重组载脂蛋白A-IV,及生物素标记的重组载脂蛋白A-IV（约46Kd）的成功纯化与表达。

1.2载脂蛋白A-IV是血小板整合素GPIIbIIIa的新型配体应用流式细胞技术,免疫沉淀,酶联免疫吸附剂测定（Enzymelinkedimmunosorbentassay,简称ELISA）,和生物膜力探针试验（Biomembrane-Force-Probe,简称BFP）证明了载脂蛋白A-IV能特异地结合血小板整合素GPIIbIIIa。

抗GPIIIa（即β3）整合素的特异抗体M1,可以彻底消除载脂蛋白A-IV与整合素GPIIbIIIa在这些检测中的结合作用。

BFP动力学测量显示载脂蛋白A-IV与整合素GPIIbIIIa之间的有效二维亲和力（2.13×

10-4μm4）是纤维蛋白原与整合素GPIIbIIIa间亲和力（4.99×

10-4μm4）的43%。

流式细胞技术,ELISA和BFP竞争性分析证明载脂蛋白A-IV可以竞争性且剂量依赖性地抑制纤维蛋白原与整合素GPIIbIIIa的相互作用。

ELISA显示整合素经典的配体结合位点——精氨酸-甘氨酸-丝氨酸抑制载脂蛋白A-IV与整合素GPIIbIIIa的相互作用。

这些实验证实了载脂蛋白A-IV是GPIIbIIIa的新型特异性配体。

1.3载脂蛋白A-IV抑制人与鼠血小板聚集血小板聚集实验检测证明了重组人或鼠载脂蛋白A-IV能明显地抑制激活剂ADP,胶原蛋白,凝血酶和凝血酶受体激动肽激活的血小板聚集（约20%-40%）。

载脂蛋白A-IV过表达（约3倍）的小鼠呈现出约50%减少的血小板聚集的特性。

1.4在血液流动的情况下,载脂蛋白A-IV抑制体外血栓形成制备四维室腔人与动物的血栓模型。

实验证明了无论在高血流剪切力（1800s-1,模拟动脉血流）或是低血流剪切力（300s-1,模拟静脉血流）下,载脂蛋白A-IV基因敲除小鼠的血小板血栓比野生型小鼠的增多约50%。

经过重组载脂蛋白A-IV治疗的健康人的全血也在高与低血流剪切力下显示出明显抑制的血小板血栓形成（约60%-80%）。

1.5载脂蛋白A-IV的N-末端天冬氨酸（D5和D13）是其抑制血小板功能和血栓形成的关键序列制备载脂蛋白A-IV双D突变蛋白,即同时拥有载脂蛋白A-IV的N-末端两个天冬氨酸（D5和D13）突变为谷氨酰胺（E）的突变蛋白。

血小板聚集实验和室腔血栓形成模型实验显示了载脂蛋白A-IV双D突变导致其抑制体外血小板聚集和血小板血栓形成作用的完全消失。

相应的是,BFP黏附频率实验证明了双D突变的载脂蛋白A-IV未能与整合素GPIIbIIIa黏附,说明载脂蛋白A-IV的D5和D13是其与整合素GPIIbIIIa的潜在结合位点,是其抑制血小板功能和血栓形成的关键序列。

1.6载脂蛋白-IV的抗血栓作用随着血流剪切力的升高而增强室腔血栓形成模型实验提示载脂蛋白A-IV的抑制血栓的效应随着血流剪切力的升高而不断增强（从300s-到5000s-）。

1.7载脂蛋白A-IV双D突变并未影响载脂蛋白A-IV的结构和稳定性应用体积排阻色谱,圆二色性（CD）光谱波长扫描测定和热变性测定显示重组载脂蛋白A-IV及重组载脂蛋白A-IV双D突变蛋白拥有相同的二级结构及稳定性。

1.8载脂蛋白A-IV抑制小鼠体内血栓形成激光损伤小鼠提睾肌小动脉的体内显微摄影血栓模型显示载脂蛋白A-IV基因敲除的小鼠出现加速的血栓形成和血管闭塞。

静脉注射重组载脂蛋白A-IV减少了血栓形成,然而双D突变蛋白的抑制血栓的功能消失。

1.9体内动态监测载脂蛋白A-IV的作用部位及蛋白沉积运用激光损伤小鼠提睾肌小动脉体内显微摄影血栓模型,发现载脂蛋白A-IV在体内呈现一种独特的沉积方式:

载脂蛋白A-IV可在血管损伤后沉积在血管壁以及血栓的顶部。

这说明了载脂蛋白A-IV与血小板在体内的相互作用。

1.10载脂蛋白A-IV抑制餐后的血小板功能亢进野生型小鼠高脂饮食后,出现餐后血小板功能的明显亢进。

载脂蛋白A-IV过表达转基因小鼠高脂饮食后出现血浆载脂蛋白A-IV水平的快速升高,从而抑制了餐后血小板功能亢进引起的血小板聚集。

相应的,载脂蛋白A-IV基因敲除或减少的小鼠,高脂饮食餐后血小板功能比野生型小鼠更为亢进。

这些实验证明了载脂蛋白A-IV是体内一个重要的抑制餐后血小板功能亢进的保护蛋白,可以预防动脉粥样硬化的发生和进展。

1.11一天中人血浆载脂蛋白A-IV呈现昼夜节律且与血小板聚集功能呈负相关20例健康人纳入这项旨在探讨血浆载脂蛋白A-IV水平与血小板聚集功能相关性的人体实验研究。

研究证明人群在早上6点时出现一天中最高的血小板聚集。

人群中的血浆载脂蛋白A-IV也存在昼夜节律,在深夜0点时出现最高峰却在早上6点出现最低值。

绝大多数人（16/20）在一天之间血浆载脂蛋白A-IV水平和血小板聚集水平存在负相关。

因此,载脂蛋白A-IV清晨水平最低的现象可能是清晨高血小板聚集的主要原因,故而导致心脑血管疾病血栓事件在此时段的高发。

2.“心胆论治”针灸抗动脉粥样硬化斑块的临床及分子生物学机制研究2.1针灸能有效地减少颈动脉粥样硬化患者颈动脉内中膜厚度,颈动脉粥样斑块的厚度以及面积每周2次,共8周的“心胆论治”针灸方案的治疗能有效地减少23例颈动脉粥样硬化患者的颈动脉内膜中层厚度,颈动脉粥样斑块的总厚度（即Crouse积分）约16%,以及减少斑块面积约20%（P&

lt;

0.05）。

无论斑块性质是硬斑、软斑或是混合斑,“心胆论治”针灸方案对不同性质斑块的治疗效果暂无显著性差异。

由于目前西药对照组的例数仍较少,阿司匹林联合立普妥治疗后有抑制颈动脉粥样硬化的趋势,但尚未达到统计学差异。

2.2针灸未能明显地改善颈动脉粥样硬化患者的血浆总胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯和脂蛋白（a）水平经针灸治疗后,颈动脉粥样硬化患者的总胆固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯水平无明显变化（P&

gt;

脂蛋白（a）有改善的趋势,但无统计学差异（P=0.11）。

这些数据说明了“心胆论治”针灸不是通过调节这些血脂水平来抑制动脉粥样硬化斑块的。

阿司匹林联合立普妥治疗后可改善患者血浆总胆固醇和低密度脂蛋白水平（P&

2.3针灸可显著抑制颈动脉粥样硬化患者的血小板聚集能力针灸治疗能有效地抑制颈动脉粥样硬化患者ADP激活的血小板聚集功能（P&

0.05）,提示“心胆论治”针灸可通过抑制血小板功能,从而减少或消退动脉粥样硬化斑块的形成。

阿司匹林联合立普妥治疗后有缓解ADP激活的血小板聚集的趋势,但尚未达到统计学差异（P=0.12）。

2.4针灸对颈动脉粥样硬化患者的纤维蛋白原水平,凝血功能以及血小板计数无显著影响经针灸治疗后,颈动脉粥样硬化患者的凝血功能,包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、和纤维蛋白原（Fg）都无明显影响（P&

同时,血小板计数在针灸治疗前后亦无明显变化（P&

因此,“心胆论治”针灸不是通过降低纤维蛋白原的水平或者血小板计数来抑制血小板的聚集功能。

阿司匹林联合立普妥治疗后患者的血浆纤维蛋白原水平和血小板数目也无明显变化。

2.5针灸可显著提升健康人群中血浆载脂蛋白A-IV的水平和其昼夜节律水平“心胆论治”针灸1次后,健康人24小时后血浆载脂蛋白A-IV得到明显的提升（P&

0.05;

n=7）。

针灸似乎不是在2小时内急性地升高载脂蛋白A-IV水平的,却在24-48小时后升高（n=4）。

每周2次的“心胆论治“针灸（第1天与第4天针灸）可持续提升健康受试者血浆载脂蛋白A-IV水平并在第7天达到最高的血浆水平。

同时,受试者在接收针灸治疗2次后,载脂蛋白A-IV的昼夜节律水平也有整体的提升,并且显著提高载脂蛋白A-IV清晨6点的水平。

这对于预防清晨高发的血栓性事件如中风和心梗等,具有重要的意义。

2.6针灸可升高颈动脉粥样硬化患者的血浆载脂蛋白A-IV水平颈动脉粥样硬化患者在接收“心胆论治”针灸方案治疗后,第15天,第30天与第8周的血浆载脂蛋白A-IV水平皆有不同程度的升高。

前期基础研究证明载脂蛋白A-IV是血小板聚集和动脉粥样硬化的新型抑制蛋白。

针灸通过提升载脂蛋白A-IV水平,可以抑制血小板的聚集,以及血小板功能亢进所启动的动脉粥样硬化的形成和斑块的进展。

结论:

1.动物实验和人体实验研究证明载脂蛋白A-IV通过拮抗血小板整合素GPIIbIIIa的活性,抑制血小板聚集和血栓形成,餐后血小板功能亢进症,并且还可以减慢动脉粥样硬化的进展（即动脉粥样硬化血栓形成的早期阶段和晚期阶段）。

人类载脂蛋白A-IV存在昼夜节律变化,与血小板聚集和心血管事件的风险负相关。

因此,载脂蛋白A-IV是新型的天然的抗动脉粥样硬化血栓的抑制蛋白。

2.证实“心胆论治”针灸方案可有效治疗动脉粥样硬化斑块。

针灸通过升高载脂蛋白A-IV的血浆水平,抑制血小板的活化与聚集,从而减少或消退动脉粥样硬化斑块的形成。

载脂蛋白A-IV与血小板的相互作用可能介导了针灸抗动脉粥样硬化血栓的效应。