武汉地区妇女宫颈感染人乳头瘤病毒基因型分析Word文档下载推荐.docx
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高危型HPV主要是HPV16和18,其次是HPV58、33、56。
【关键词】宫颈;
人乳头瘤病毒;
基因型
AnalysisofHumanPapillomavirusGenotypeDistributioninCervicalLesionofWomeninWuhan
HUXingwen
(MaternalandChildHealthHospitalofHubei,Wuhan,Hubei430070,China)
Abstract:
ObjectiveToinvestigatehumanpapillomavirus(HPV)genotypedistributionincervicallesionofwomeninWuhan.Methods18highriskHPV(hrHPV)genotypesand5lowriskHPV(lrHPV)genotypesincervicallesionofwomenweredetectedbygenechiptechniqe.ResultsOf606casesweredetected,391caseswereHPVpositive(%).274caseswerehrHPVpositive(%).117caseswereonlylrHPVpositive(%).AmonghrHPVinfection,HPV16wasthemostcommongenotype(%),followedbyHPV18(%),HPV58(%),HPV33(%),andHPV56(%)respectively.AmongHPVinfectioncases,332casesweresingleHPVinfection(%),53casesweredoubleHPVinfection(%),and6casesweretripleHPVinfection(%).ConclusionHPVinfectionincervicallesionofwomenwassevereinWuhan.MostofthemweresingleHPVinfection.HPV16wasthemostcommongenotype,followedbyHPV18,HPV58,HPV33,andHPV56.
Keywords:
Cervical;
Humanpapillomavirus;
Genotype
宫颈癌是全世界妇女第二位最容易发生的癌症,每年新诊断出约470000例,每年死亡人数达250000[1]。
HPV是宫颈癌发展的必要因素[2~5]。
在感染人类的人乳头瘤病毒(HPV)中,已经测定基因序列的有100多种基因型[6]。
在全世界,不同的地域,HPV流行的基因型有所差异,了解武汉地区妇女宫颈感染的HPV基因型分布情况,对监控HPV感染疫情和将来使用HPV疫苗来预防宫颈癌的发生有很重要的指导意义。
1材料和方法
材料
研究对象606例标本来自我院妇科门诊2005年1月至2006年12月诊断为宫颈上皮内瘤样变Ⅰ级以上的患者,年龄16岁~60岁,平均年龄(±
)岁。
试剂和仪器HPV分型基因芯片检测系统(亚能生物技术有限公司,深圳);
Biometra基因扩增仪(德国),FYY3型分子杂交仪(江苏兴化分析仪器厂)。
显色液须新鲜配制,按顺序加入以下溶液:
C液(mol/L柠檬酸钠,pH)19ml,四甲基联苯胺1ml,体积分数3%H2O210μl。
20倍SSC,质量分数10%的十二烷基硫酸钠(SDS)、1mol/L柠檬酸钠均为深圳亚能生物技术有限公司提供,用时按所需浓度加蒸馏水配制。
方法
标本的采集及保存方法用专用毛刷,紧贴宫颈口黏膜,稍用力转动2周,以取得脱落细胞,将取样后的毛刷放入备有1ml无菌生理盐水的试管中,充分漂洗后将毛刷贴壁挤干丢弃。
采集的样本没有及时检测时则放在-20℃保存。
样本处理方法将漂洗过毛刷的生理盐水全部转移到ml离心管中,13000r/min离心10min,弃去上清,保留管底的细胞块。
加入50μl裂解液充分混合,100℃加热10min。
13000r/min离心10min,保留上清待用。
HPV基因芯片检测PCR扩增取PCR反应管一支,做好标记,于5000r/min离心2s,加入已提取的待测样品DNA5μl,反应总体系为25μl。
每次实验设置一个阴性对照,即以5μl无菌纯水为模板。
扩增条件:
50℃,15min;
95℃,10min;
而后循环40次(94℃,30s;
42℃,90s;
72℃,30s);
72℃延伸5min。
杂交及洗膜取固定有23种HPV分型探针的膜条放入塑料离心管,加入A液(2SSC)及PCR产物,将塑料管放入沸水中加热10min后,放入杂交箱51℃杂交1h。
于51℃轻摇洗涤15min。
膜条转移至已于杂交箱中预热到51℃的40mlB液(SSC)管中,轻摇洗涤15min,弃液体。
显色膜条置于POD溶液室温轻摇浸泡30min,弃去POD溶液。
用A液室温轻摇洗2次,5min/次。
用C液室温洗膜1min~2min,将膜条浸泡于显色液中避光10min左右即可见斑点显现,若显色液较弱可适当延长显色时间,显色完毕将膜条浸泡在水中清洗,最后取出膜条于4℃保存。
结果判定作为阴性对照的杂交膜条会在PC位置出现蓝色斑点,同时其他位点不应该显色;
检测用的每张膜条在PC处均应有蓝色斑点出现,此时结果的判读视为有效。
膜条上的探针排列顺序HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、45、51、52、53、56、58、44、59、66、68、73、83、MM4、PC。
由斑点显现的位置即可断定HPV的基因型。
其中,低危型:
HPV6、11、42、43、44。
其他为高危型:
HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4。
2结果
总共检测606例,HPV总感染例数391例,感染率为%。
检出的基因型有低危型HPV6、11、42和高危型HPV16、18、31、33、35、45、53、56、58、59、68、73,见表1。
未检出的基因型有低危型HPV43、44和高危型HPV39、51、52、66、83、MM4。
高危型HPV感染人数274例,感染率为%,在高危型基因型中,HPV16和18共占%,其他基因型共占%,感染率排在前5位的依次是HPV16、18、58、33、56。
单一基因型感染332例,占感染人数的%。
两重感染53例,占感染人数的%,其中,高危型和低危型混合感染32例,占两重感染的%;
两者均为高危型感染18例,占两重感染的%;
两者均为低危型感染3例,占两重感染的%,见表2。
三重感染6例,占感染人数的%,其中高危型和低危型混合感染5例,三者均为高危型感染1例,见表3。
表1HPV基因型的分布
表2HPV两重感染基因型分布
表3HPV三重感染基因型分布
3讨论
武汉地区检查的606例妇女宫颈病变患者HPV感染率达到%,比深圳[7]、广州[8]、广西[9]、粤东地区[10]都高,这可能与筛查的患者和检查方法有关,筛查对象的宫颈病变越严重,HPV感染率可能越高;
另外,检查的基因型越多,漏检率越小,HPV的感染率也就越高。
在高危型HPV感染中,武汉地区感染率最高的是HPV16,其后依次是HPV18、HPV58、HPV33、HPV56等。
不同的地区,流行的基因型有所不同,广州地区排在前5位的分别为HPV52、16、51、58、68[8],粤东地区排在前5位的分别为HPV16、18、58、33、73[10],香港地区感染率最高的是HPV16、18[11]。
在非洲感染率排在前5位的分别是HPV52、35、58、51、16[12];
在印度是HPV16、18、33、58、35[13];
在美国是HPV56、53、16、58、52[14];
在澳大利亚是HPV16、18、45、39、73[15]。
在世界范围内,HPV16是与宫颈癌联系最紧密的基因型,并随地域变化很小[16]。
在武汉地区HPV感染患者中,大多数是单一基因型感染,单一基因型感染占感染人数的%,两重感染的占%,感染基因型最多的也只有三重感染,三重感染占%,非洲有些患者可同时感染有7种基因型[12],由于HPV属于性传播疾病,患者和(或)对方性伙伴越多,多重感染的基因型可能就越多。
武汉地区两重感染的主要是低危型HPV和高危型HPV混合感染,占%;
其次是两者均为高危型HPV感染,占%;
两者均为低危型HPV只占%。
大多数HPV感染者是短暂无症状,并且自身能够把病毒清除掉,只有持久感染高危型HPV,就会增加发展成为宫颈癌的风险性[2,17~20]。
自身清除病毒,多重基因型感染可能比单一基因型难,HPV16是最难清除掉的基因型。
妇女感染高危型HPV后,在随后的6年中发展成CINⅢ级病变的风险比未感染者高210倍[21],国外正进行研究HPV疫苗来预防HPV的感染,但HPV的基因型比较多,国外主要是研究HPV16和18两价疫苗,一般是在第一次性生活之前13岁~14岁左右接种[22]。
武汉地区高危型HPV也主要以HPV16、18为主,占%,其他高危型HPV共占%,但若接种HPV16/18两价疫苗,将会仍有将近30%的机会感染其他高危型HPV基因型而不能预防。
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