生物化学Word文档格式.docx
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1)细胞生长与分裂失去控制。
核质比例增大,分裂速度加快,破坏了原有正常组织的结构与功能。
2)具有侵润性和扩散性。
这是癌细胞的基本特征,易于侵润周围健康组织,或通过血液循环、淋巴途径转移并在其他部分粘着和增殖。
3)细胞间相互作用改变。
癌细胞冲破了细胞识别作用的束缚。
4)蛋白表达谱系或蛋白活性改变。
5)mRNA转录谱系的改变。
在肿瘤组织中只有极少数的肿瘤细胞能够进行转移:
①肿瘤细胞侵袭周围的组织和血管,②肿瘤细胞经由循环系统进行转移;
③在新的部位生长形成肿瘤。
血管生成是肿瘤转移的前提和基础,通常情况下,没有新生血管生成的恶性肿瘤往往生长缓慢。
原发肿瘤,病变长期处于静止状态仅能局部浸润尚不能发生转移。
当肿瘤继续生长其直径大于2mm时,分泌大量血管内皮生长因子(VEGF),促使供应肿瘤的微血管逐渐形成,瘤实体随之迅速增大,拥有血供的大量肿瘤细胞借助血管,通过循环系统向远处侵袭、转移。
因此,新生血管形成是肿瘤转移连锁过程开始的关键环节,抗肿瘤血管生成的研究成为了治疗肿瘤的重要手段。
蛋白质构型、构象和蛋白质结构的组织层次
构型(configuration):
指在具有相同结构式的立体异构体中取代基团在空间的相对取向,不同的构型如果没有共价键的破裂是不能互变的。
构象(conformation):
指具有相同结构式和相同构型的分子在空间里可能的多种形态,构象形态间的改变不涉及共价键的破裂。
蛋白质结构的不同组织层次:
一级结构(primarystructure):
指多肽链的氨基酸序列。
二级结构(secondarystructure):
指多肽链借助氢键排列成自己特有的α螺旋和β折叠股片段,这些片段构成所谓规则结构,能够像弹簧的螺圈沿一维方向延展,是多肽链在空间的三维排列中的一个高级组织层次。
三级结构(tertiarystructure):
指多肽链借助各种非共价键弯曲、折叠成具有特定走向的紧密球状构象,球状构象给出最低的表面积和体积之比,因而使蛋白质与周围的相互作用降到最小。
四级结构(quaternarystructure):
指寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系和结合方式。
除蛋白质的一级结构式由多肽链主链上共价链接的氨基酸残基决定的,其他结构层次主要是由非共价力决定。
除了可以分为4个组织层次,细分到在二级结构和三级结构之间增加两个层次:
超二级结构(super-secondarystructure):
指特别是在球状蛋白质分子中若干相邻的二级结构元件组合在一起,彼此相互作用,形成种类不多的、有规则的二级结构组合体,在多种蛋白质中充当三级结构的构件。
结构域(domain):
又称功能域(functionaldomain),指多肽链在二级结构的基础上形成二级结构的局部折叠区,它是相对独立的紧密球状实体。
蛋白质功能的多样性
蛋白质的生物功能决定于它的高级结构,高级结构是由一级结构即氨基酸序列决定的,而氨基酸序列是由遗传物质DNA的核苷酸序列规定的。
蛋白质序列异构现象是蛋白质生物功能多样性和物种特异性的结构基础。
蛋白质是生物功能的载体,其生物学功能主要包含:
1)催化~酶(enzyme)最为生物体新陈代谢的催化剂,几乎参与生物体内各种化学反应,其催化效率远远大于合成的催化剂。
2)调节~许多具有调节其他蛋白质执行其生理功能能力的调节蛋白,如胰腺β细胞分泌的胰岛素,另一类调节蛋白参与基因表达的调控,它们是激活或是抑制遗传信息转录为RNA。
3)转运~转运蛋白功能是从一地到另一地转运特定的物质。
4)储存~蛋白质是氨基酸的聚合物,又因氮素通常是生长的限制性养分,所以生物体必要时就利用蛋白质作为提供充足氮素的一种方式。
同理还能为生物体发育提供C、H、S甚至Fe元素。
5)运动~某些蛋白赋予细胞以运动的能力,肌肉收缩和细胞游动是细胞具有这种能力的代表。
6)结构成分~蛋白质能够建造和维持生物体的结构,给细胞核组织提供强度和保护。
7)支架作用~在细胞应答激素和生长因子的复杂途径中起作用的支架蛋白或接头蛋白(adapterprotein),蛋白质结构的特定结构通过蛋白-蛋白相互作用能识别并结合其他蛋白中的某些结构元件。
8)防御和进攻~与一些结构蛋白的被动性防护不同,一类保护或开发蛋白的蛋白质在细胞防御、保护和开发方面的作用是主动的。
9)异常功能~
蛋白质测序的策略
测定蛋白质的一级结构,样品必须是均一的,纯度至少97%以上,必须知道它的相对分子质量,其误差允许在10%左右。
多肽链的氨基酸序列测序一般策略:
1)测定蛋白质分子中多肽链的数目;
2)拆分蛋白质分子的多肽链;
3)断开多肽链内的二硫桥;
4)分析每一多肽链的氨基酸组成;
5)鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基;
6)裂解多肽链成较小的片段;
7)测定各肽段的氨基酸序列;
8)重建完整多肽链的氨基酸序列;
9)确定半胱氨酸残基间形成的S-S交联桥位置。
稳定蛋白质三维结构的作用力
非共价力(如氢键、离子键、范德华力和疏水作用)
氢键(hydrogenbond):
分子间作用力的一种,是稳定蛋白质二级结构的主要作用力。
发生在已经以共价键与其它原子键合的氢原子与另一个原子之间,通常发生氢键作用的氢原子两边的原子,都是电负性较强的原子。
范德华力(vanderWaalsforce):
中性原子之间通过瞬间静电相互作用产生的一种弱的分子间的力。
当两个原子之间的距离为它们的范德华半径之和时,范德华力最强。
离子键(ionicbond):
又称盐键,带相反电荷的基团之间的静电相互作用,因加入非极性溶剂而加强,加入盐类而减弱。
疏水作用/键(hydrophobicinteraction/bond):
水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部的现象,疏水基团出自避开水的需要而被迫接近,而非之间产生何种吸引力,在生理温度范围内睡温度升高而加强。
共价二硫键(disulfidebond):
多在多肽链的β转角附近形成,指在肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键。
蛋白质折叠和结构预测
蛋白质的变性(denaturation):
天然蛋白质分子受到某些物理因素或化学因素,生物活性丧失,溶解度降低,不对称性增高以及其他物理化学常数发生改变的过程。
变性的实质是蛋白质分子中的次级键被破坏,引起天然构象解体,不涉及共价键的破裂,一级结构仍保持完好。
变性过程中往往发生:
1)生物活性的丧失;
2)一些侧链基团的暴露;
3)一些物理化学性质的改变;
4)生物化学性质的改变。
复性(renaturation):
当变性因素除去后,变性蛋白质又可重新回复到天然构象的过程。
对称性是四级结构蛋白质最重要的性质之一。
四级缔合在结构和功能上的优越性:
1)增强结构稳定性;
2)提高遗传经济性和效率;
3)是催化基团汇集在一起;
4)具有协同性和别构效应。
蛋白质结构域功能的关系
肌红蛋白(myoglobin,Mb)是哺乳动物细胞主要是肌细胞存储和分配氧的蛋白质。
是由一条多肽链和一个辅基血红素构成,含有153个氨基酸残基。
血红蛋白(hemoglobin,Hb)的主要功能是在血液中结合并转运氧气。
脊椎动物中血红蛋白由4个多肽亚基组成,每个亚基都有一个血红素基和一个氧结合部位。
免疫(immunity)是脊椎动物最重要的防御机制,免疫反应是由两个互补的系统组成:
体液免疫系统(humoralimmunesystem),是针对细菌感染,胞外病毒以及进入生物体的外来蛋白质等;
细胞免疫系统(cellularimmunesystem),是破坏被病毒感染的宿主细胞、某些寄生物和外来的移植组织。
免疫球蛋白,又称抗体,是一类可溶性的血清糖蛋白,是血清中最丰富的蛋白质之一。
具有高度的特异性和庞大的多样性等特点。
IgG是血清中最基本的一类抗体,是记忆B细胞引发的再次免疫反应中的主要抗体,IgG是有4条多肽链组成,含有两个抗原结合部位。
基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法
ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay),即酶联免疫吸附测定,能快速筛查和定量一个抗原在样品中的存在。
以待测抗原或抗体和酶标抗体的特异结合反应为基础,然后通过酶活力测定来确定含量。
步骤:
1)用样品包被表面,样品中含待测抗原和其他蛋白;
2)用非特异性蛋白质封闭未被结合的部位;
3)与抗待测抗原的第一抗体温育;
4)与酶联的第二抗体温育;
5)加入底物;
6)形成有色产物或荧光表明待测抗原的存在。
免疫印迹测定(immunoblotassay),或称Western印迹,能检测样品中的微量成分和近似相对分子质量。
对蛋白质样品进行凝胶电泳分离,然后凝胶板与硝酸纤维膜贴在一起,进行电泳转移,将凝胶上的蛋白条带转移到纤维膜上。
用纤维封闭,然后相继用一抗、酶标二抗以及底物进行处理,只有在含待测蛋白质的条带显示颜色。
制备单克隆抗体的步骤:
1)用感兴趣的抗原,如尿激酶免疫小鼠脾脏,制成B淋巴细胞悬液;
2)繁殖小鼠骨髓瘤细胞;
3)制得的B细胞与骨髓瘤细胞融合,产生杂交瘤,它在培养物中能不断增殖,当只合成一种抗体;
4)细胞转移到只有杂交瘤细胞才能生长的介质上进行选择性培养;
5)用ELISA筛查并找出分泌抗目的蛋白质的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
6)对所得细胞株进行扩大化培养,从培养物中纯化所需单克隆抗体。
免疫荧光技术(immunofluorescence):
通过抗原-抗体特异结合,与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法能通过形态学直接观察目的蛋白在细胞中的定位。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。
包括两个部分:
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法;
用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。
蛋白质的分离、纯化
蛋白质的沉淀(precipitation):
蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。
在外界因素影响下,破坏了蛋白质溶液的稳定性,蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
方法:
1)盐析法;
2)有机溶剂沉淀法;
3)重金属盐沉淀法;
4)生物碱试剂和某种酸类沉淀法;
5)加热变性沉淀法。
蛋白质分离(separation)和纯化(purification),纯化的总目标是增加制品的纯度或比活,以增加单位蛋白重量中所要蛋白质的含量或生物活性。
根据蛋白质的性质(1.分子大小2.溶解度3.电荷4.吸附性质5.对配体分子的生物学亲和力)进行分离纯化。
根据分子大小不同的纯化方法:
1)透析(dialysis)是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质,使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。
超过滤(ultrafiltration)是利用压力或离心力,强行使水和其他小分子溶质通过半透膜,而蛋白质被截留在膜上,以达到浓缩和脱盐的目的。
2)密度梯度(densitygradient)离心,若蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时,质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快,最后各种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时,即停止不前,最后分离成各自独立的区带,分成区带的蛋白质可以在管底刺一个小孔逐滴放出,分部收集。
3)凝胶过滤:
流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠的内外随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下移动并最先流出柱外,比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。
利用溶解度差别的纯化方法:
1)等电点沉淀和ph控制;
2)盐溶(saltingin):
中性盐可以增加蛋白质溶解度的现象,蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,与水分子间的相互作用却加强,因而溶解度增高。
盐析(saltingout):
当离子强度增加到足够高时,很多蛋白质可以冲水溶液中沉淀出来的现象。
3)有机溶剂分级:
通过改变介质的介电常数进行分离法。
4)温度:
一定温度范围内0°
~40°
之间是,大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加,大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质的分级分离操作一般都在0°
或更低温度下进行。
根据电荷不同的纯化方法:
1)电泳(electrophoresis),又称离子泳(ionphoresis),在外电场的作用下,带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动的现象。
2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
3)毛细管电泳(capillaryelectrophoresis);
4)等点聚焦(isoelectricfocusing,IEF),可以用于蛋白质等电点的测定。
5)层析聚焦(chromatofocusing);
6)离子交换层析。
层析(chromatography):
按照在移动相(可以是气体或液体)和固定相(可以是液体或固体)之间的分配比例将混合成分分开的技术。
酶的分离和纯化
酶(enzyme)是细胞所产生,受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂,特点:
1)易失活;
2)具有很高的催化效率;
3)具有高度专一性;
4)活性受到调节和控制。
酶的分离纯化是酶学研究的基础,研究酶的性质、作用、反应动力学、结构与功能的关系、阐明代谢途径,作为工具酶等都需要高度纯化的酶制剂以免除其他酶或蛋白质的干扰。
已知绝大多数酶是蛋白质,因此酶的分离提纯方法,便是常用来提纯蛋白质的方法,主要包括:
1)把酶制剂从很大体积浓缩到较小的体积;
2)把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。
判断分离纯化方法的优劣,一般用两个指标来衡量:
总活力的回收(表示提纯过程中酶的损失情况),和比活力提高的倍数(表示提纯方法的有效程度)。
用一系列分离蛋白质的方法,如盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级、选择性热变性等方法从酶粗提液中初步分离酶。
再采用吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析、疏水层析及高效液相色谱法等层析技术或各种制备电泳技术进一步纯化酶,以得到较纯的酶制品。
为了得到较理想的纯化结果,根据不同酶的特点,往往采用几种方法配合使用。
分离纯化酶的过程中应注意:
1)选择酶含量丰富的新鲜生物材料,若不是获得材料后立即提纯,应在低温下保存;
2)区分细胞来源不同,选用适合的细胞破碎工具;
3)在低温下,以水或低盐缓冲液,从组织匀浆中抽提酶,得到酶的粗提液;
4)酶是生物活性物质,为了避免酶活性损失,操作条件要温和,全部分离纯化操作要在0~5°
间进行;
5)获得较纯的酶溶液后将酶进行结晶,可以把盐加入一个比较浓的酶溶液中至微呈浑浊为止,或者改变溶液的pH及温度,轻轻摩擦玻璃壁等方法以便达到结晶的目的;
6)由于酶溶液浓度越低越容易变性,不能直接保存酶的稀溶液。
通常将纯化后的酶溶液经透析除盐后冷冻干燥得到酶粉,在低温下较长时间保存。
氨基酸的分类及其特性
氨基酸(aminoacid)是蛋白质的构件分子,氨基酸通过一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间形成的肽键而首尾相连,构成多肽链,蛋白质结构和功能上的多样性是由20种常见氨基酸的内在性质造成的。
氨基酸性质包括:
1)聚合能力;
2)特有的酸碱性质;
3)侧链的结构及其化学功能的多样性;
4)手性。
参与蛋白质组成的20种氨基酸成为蛋白质氨基酸,按R基的化学结构进行分类,可分为脂肪族、芳香族和杂环族。
按R基的极性性质分类,可分为非极性R基氨基酸、带电荷的R基氨基酸和不带电荷的极性R基氨基酸。
不同生物合成氨基酸的能力不同,合成氨基酸的种类也大有差异。
必需氨基酸(essentialaminoacid):
指人体(和其它哺乳动物)自身不能合成,机体又必需,需要从饮食中获得的氨基酸。
稀有氨基酸(rareaminoacid):
指存在于蛋白质中的20种常见氨基酸以外的其它罕见氨基酸,它们是正常氨基酸的衍生物。
非蛋白质氨基酸(non-proteinaminoacid):
指不存在于蛋白质分子中而以游离状态和结合状态存在于生物体的各种组织和细胞的氨基酸。
生物氧化-电子传递和氧化磷酸化作用
生物氧化(biologicaloxidation):
有机分子在细胞内氧化分解成CO2和水,并释放出能量形成ATP的过程。
在细胞内进行,氧化过程消耗氧放出二氧化碳和水。
氧化磷酸化(oxidativephosphorylation),是生物氧化的实质,由NADH和FADH2上的电子通过一系列电子传递载体传递给O2,伴随NADH和FADH2的再氧化,将释放的能量使ADP磷酸化形成ATP的过程。
真核生物的电子传递和氧化磷酸化都是在细胞的线粒体内膜发生的作用。
氧化磷酸化的调控:
电子传递和ATP形成的偶联关系是相辅相成的,ATP的生成必须以电子传递为前提,而呼吸链只有生成ATP才能推动电子的传递。
底物水平磷酸化(substratelevelphosphorlation):
指ATP的形成直接由一个代谢中间产物上的磷酸基团转移到ADP分子上的作用。
物质在生物氧化过程中,常生成一些含有高能键的化合物,而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成,这种产生ATP等高能分子的方式。
呼吸链(respiratorychain):
又称电子传递链,是指线粒体内膜上一系列氢载体和电子载体蛋白,具有传递电子的作用,它们在内膜上有序地排列成相互关联的链状。
是电子从NADH到O2的传递所经过的途径,主要由蛋白质复合体组成。
磷氧比值(P/Oratio):
氧化磷酸化作用中,每消耗1个O2分子约合成3个ATP分子的磷-氧比例。
比值的大小根据电子进入电子传递链的位置。
能荷(energycharge):
是细胞中高能磷酸状态的一种数量上的衡量,能荷大小可以说明生物体中ATP-ADP-AMP系统的能量状态。
核酸的种类和生物功能
核酸(nucleicacid)的基本结构单位是核苷酸,由一个含氮碱基(嘌呤或嘧啶),一个戊糖(核糖或脱氧核糖)和一个或几个磷酸组成,是一种多聚核苷酸,靠磷酸二酯键彼此连接在一起。
有两类:
脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA),通常为双链结构,含有D-2-脱氧核糖,是主要的遗传物质。
核糖核酸(ribonucleicacid,RNA),为单链结构,并以尿嘧啶取代DNA中的胸腺嘧啶,参与蛋白质的生物合成。
RNA的核心作用是基因表达的信息加工和调节,主要有5类功能:
1)控制蛋白质合成;
2)作用于RNA转录后加工与修饰;
3)基因表达与细胞功能的调节;
4)生物催化与其他细胞持家功能;
5)遗传信息的加工与进化。
核酸的物理化学性质
核酸的变性(denaturation):
指核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链,并不涉及共价键的断裂。
由温度升高而引起的称热变性;
由酸碱度改变引起的称酸碱变性。
核酸的复性(renaturation):
变性DNA在适当条件下,又可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构的过程。
退火(annealing):
变性DNA在缓慢冷却时,可以复性的过程。
DNA片段越大,复性越慢;
DNA浓度越大,复性越快。
DNA的熔解温度(meltingtemperature,Tm值):
核酸变性时物理化学性质将发生改变,热变性一半时的温度。
DNA的GC含量影响Tm值。
限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease):
能作用于核酸分子内部,主要是降解DNA,具有很严格的碱基序列转移性。
是基因工程中的重要工具酶。
分子杂交(molecularhybridization):
不同的DNA片段之间,DNA片段与RNA片段之间,如果彼此间的核苷酸排列顺序互补也可以复性,形成新的双螺旋结构。
这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸相互结合的过程。
核酸的分离、提纯
核酸制备中共同需要注意的是防止核酸的降解和变性,要保持其在生物体的天然状态,必须采用温和的条件,防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌,尤其防止核酸酶的作用。
分离DNA的方法:
1)用盐抽提,用苯酚和氯仿除去蛋白质;
2)用光谱蛋白酶在SDS存在下保温消化细胞悬液,再用苯酚和氯仿除去蛋白,用RNase除去少量的RNA;
3)用氯化铯密度离心法分离纯化DNA。
分离RNA的方法:
1)用苯酚、氯仿抽提;
2)用氯化铯密度梯度离心。
制备RNA要防止RNase的降解:
1)器皿要高温处理或用DEPC除去RNase;
2)破碎细胞的同时使蛋白质变性;
3)RNA反应体系中加入RNase抑制剂。
核酸的生物合成
DNA的复制是一个半保留复制(semiconservativereplication)的过程,即子代分子的一条链来自亲代而另一条链是新合成的,通过整个DNA分子的复制将遗传信息由亲代传给子代。
半保留复制保证了遗传信息的稳定性,通过DNA的新陈代谢来维持DNA的复制开始于特殊的起点,双向或单向进行。
不连续复制(semidiscontinuousreplication):
当DNA复制时,一条链是连续的,另一条是不连续的。
RNA的复制由RNA指导的RNA聚合酶所催化。
如一些病毒的基因组为RNA分子,也可以成为遗传信息的基本携带分子,RNA借由复制件遗传信息由亲代传递给子代分子。
通常RNA复制酶对模板有很高的特异性,并且对RNA的复制和翻译,正负链的数量等存在调控作用。
冈崎片段(Okazakifragment):
一组短的DNA片段,是在DNA复制的起始阶段产生的,随后又被DNA连接酶连接形成较长的片段。
真核生物DNA复制的冈崎片段长度约为200bp左右,相当于一个核小体DNA的长度。
不对称转录(asymmetrictranscription):
转录通常只在DNA的任一条链上进行。
反义RNA(antisenseRNA):
可通过与靶部位序列互补而与之结合,或直接阻止其功能,或改变靶部位构象而对基因表达和细胞
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