大花三色堇FPNIPCR反应体系的优化.docx
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大花三色堇FPNIPCR反应体系的优化
大花三色堇FPNI―PCR反应体系的优化
摘要:
融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusionprimerandnestedintegratedPCR,FPNI-PCR)是一种分离并扩增已知序列旁未知序列的有效方法。
以大花三色堇(Viola×wittrockianaGams.)为材料,为提高FPNI-PCR产物特异性,增加条带清晰度,降低非特异性条带的干扰,对FPNI-PCR反应体系中第1轮的模板DNA浓度进行对比,优化了第3轮反应中引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、缓冲液用量,筛选了第3轮特异性引物的退火温度,进一步完善了FPNI-PCR反应体系。
各因素优化比对试验表明:
FPNI-PCR第1轮反应体系应以稀释后的DNA为模板,20μL体系中,用量在4.5~10ng。
第3轮最优反应体系为:
20μL反应体系中,特异性引物浓度0.2μmol/L,引物SP2浓度0.75μmol/L,TaqDNA酶用量1.0U,dNTP用量2μL,10×buffer(20mmol/L,Mg2+plus)用量2μL,模板1μL(第2轮反应稀释100倍后取1μL为模板),ddH2O补足。
第3轮反应中,退火温度为64℃或66℃时条带最为清晰。
关键词:
大花三色堇;FPNI-PCR;体系优化
中图分类号:
Q785文献标志码:
A[HK]
融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusionprimerandnestedintegratedPCR,FPNI-PCR)是一种基于热不对称交错PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR)技术原理的PCR方法[1],主要是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套特异性引物,与给出的9个特殊设计的随机简并引物(arbitrarydegenerateprime,AD)相结合,进行1次巢式反应,并在简并引物的基础上设计2个嵌套的特殊引物替换第1轮PCR所用随机引物用于第2、3轮的扩增。
FPNI-PCR中融合引物(fusionprimer),即特殊设计的随机简并引物,由3′端的随机寡核苷酸(arbitrarydegenerateoligonucleotides)和5′端可设计特异引物的一段序列组成,该序列用以替换初次PCR所用简并引物。
经过热不对称循环后的产物含有特异引物结合位点,能有效降低产物稀释后非特异性扩增的影响[2]。
FPNI-PCR具有高效灵敏、产物特异性高、重复性好、能够在较短的时间内获得目标片段等优点,是扩增基因侧翼序列特别是启动子的有效方法[3]。
FPNI-PCR与TAIL-PCR技术类似,其反应产物的稳定性、可重复性明显受到反应体系模板、引物、TaqDNA聚合酶、Buffer以及3轮退火温度等因素的影响[4]。
在进行FPNI-PCR反应获取未知序列时,有必要根据上述因素,对不同因素进行优化组合,以获得最优的反应结果。
大花三色堇(Viola×wittrockianaGams.)是重要的冬春季花卉,有着十分丰富的花色和花斑类型,是研究植物花斑形成的理想植物[5]。
笔者所在实验室先前的研究表明,二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonolreductase,DFR)和花青素合成酶(anthocyanidinsynthase,ANS)基因是三色堇花斑由无色转向着色的关键性基因[6]。
关于DFR和ANS的相关研究发现,其启动子中含有的众多调控元件,与花色素调控密切相关[7-9]。
因而这2个基因的启动子结构特点,可能是花斑位置形成的一个关键性因素,其启动子的克隆,对于进一步研究三色堇色斑的形成具有十分重要的意义。
FPNI-PCR技术是克隆启动子序列的有效方法,而目前关于三色堇FPNI-PCR技术研究尚无相关报道,本研究以三色堇为材料,对其FPNI-PCR反应体系进行优化,为三色堇VwDFR和VwANS基因启动子的克隆提供技术基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
大花三色堇品种“宾哥”,花色为黄底黑斑,栽培于海南大学园艺园林学院基地。
1.2方法
1.2.1模板DNA的提取
提取三色堇幼叶DNA,步骤参考尚啸等的改良CTAB法[10],仅核酸分离时改用加1/10体积的5mol/LNaAc。
提取的DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,电泳结果通过凝胶成像仪(Dolophin-Doc,美国)拍照,利用紫外分光光度计测浓度。
小管分装-20℃保存。
1.2.2试验中用到的引物包括FPNI-PCR反应体系中的第1轮、第2轮、第3轮的简并引物、特殊引物(表1)[1]以及根据VwANS基因设计的特异引物(表2)。
1.2.3FPNI-PCR体系的优化
(1)模板DNA浓度筛选。
将提取的DNA稀释100、200倍,然后将未稀释的DNA和稀释不同倍数的DNA作为第1轮PCR反应的模板,反应采用表1中的FP5、FP6、FP7、FP9这4条简并引物,反应程序见表3,反应体系为20μL,具体组分见参考文献。
(2)FPNI-PCR反应退火温度的梯度筛选。
根据设计的特异性引物GSP3的TM值,对第3轮退火温度进行梯度筛选,筛选温度分别是62、64、66℃。
(3)引物、10×buffer(20mmol/L,Mg2+plus)、TaqDNA酶用量的对比。
PCR反应采用20μL反应体系,分别对影响第3轮反应体系中的主要参数:
引物、10×buffer(Mg2+plus)、TaqDNA酶,设置不同的浓度梯度,具体参数值见表3。
此外,每20μL反应体系中均含有dNTP(2.5mmol/L)2μL、特异性引物0.2μmol/L,模板为第2轮反应产物稀释100倍取1μL,加ddH2O补足至20μL。
逐一优化每个参数值,优化时,其他参数值均采用表3所列反应参数的第一水平值,引物采用参考文献中的FP5、FP6、FP7、FP9这4条简并引物(表1),反应程序见表4。
2结果与分析
2.1DNA的提取结果
以三色堇嫩叶为材料提取DNA,经紫外分光光度计检测,浓度为(0.901±0.019)μg/L,D260nm/D280nm介于1.8~2.0之间,说明样品DNA中杂质较少。
0.8%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,点样孔无滞留,条带清晰明亮,无明显拖尾现象,说明RNA等杂质去除较干净。
结果表明,采用改良CTAB法可以有效地提取三色堇幼叶的DNA[10],对于后续PCR反应有利。
2.2DNA的浓度对FPNI-PCR的影响
模板DNA的用量对FPNI-PCR反应有着非常直观的影响,过多或者过少都会造成产物的不稳定或者无法产生条带。
普通方法提取的DNA通常含有杂质,而杂质对PCR产物的影响是非常显著的。
为了获得清晰条带,降低非特异性扩增,本试验以3个浓度的DNA为模板,利用FP5、FP7、FP9这3种简并引物分别扩增,其他条件相同,结果如图2所示。
以未稀释DNA为模板,3轮扩增后均无清晰条带(图2)。
将DNA模板分别稀释100、200倍,随着DNA稀释倍数的增加,简并引物FP5扩增出的条带数量明显增加,且条带清晰度明显提升;简并引物FP9扩增的结果,100倍稀释比200倍稀释扩增条带数量更多、条带更加清晰(图2)。
同时,7号引物在多个模板浓度下皆无明显条带,说明利用FPNI-PCR进行扩增时,模板的稀释倍数应配合不同的简并引物进行筛选,以期降低杂质等对反应的影响,才能获得更为清晰的条带。
2.3退火温度对扩增产物的影响
通过对5、7、9号引物扩增反应的第3轮扩增的退火温度进行筛选,筛选温度为62、64、66、68℃,结果见图3。
总体来看,64、66℃反应效果更好,但是不同引物反应的最佳退火温度不同,如FP5引物64℃下扩增效果较好,FP9号中超过700bp的条带,在66℃下更清晰。
2.4Taq酶的用量对FPNI-PCR的影响
Taq酶在PCR反应体系中用量少,却极为重要,Taq酶的类型、用量,甚至是生产商,都会对PCR产物造成明显的影响。
在本研究中,分别对以FP6和FP7简并引物扩增获得的PCR产物进行Taq酶的优化,其他条件全部相同,结果如图4所示。
试验发现,Taq酶的用量对反应条带的数量和清晰度都有一定影响,随着Taq酶用量的增加,FP6和FP7扩增的PCR产物的量均有所提高,但FP6更为明显,能获得较为清晰的条带,而FP7无明显的清晰条带。
以简并引物FP6扩增,Taq酶用量1.5U时比1.0U时条带亮度只略有提升,且非特异性扩增也更为明显,表明Taq酶用量1.0U更为合适。
2.510×Taqbuffer(Mg2+plus)用量对FPNI-PCR的影响
分别以简并引物FP6和FP7进行扩增,通过改变10×Taqbuffer(Mg2+plus)用量,其他条件均相同,结果见图5。
结果显示,以简并引物FP6扩增,3种缓冲液用量均获得条带,但用量为2μL时,目的条带更为清晰;以简并引物FP7扩增,缓冲液为1.5μL时无条带,由1.75μL增至2μL时,条带数量增加,清晰度略有增加。
2.6引物浓度对FPNI-PCR的影响
以FP6和FP7这2种简并引物扩增,对第3轮引物SP2浓度进行筛选。
结果(图6)显示,引物浓度为0.25μmol/L时,均无条带,随着引物浓度的上升,条带数量、亮度明显增加,非特异性扩增同样增加,条带出现模糊现象。
由图6可知,以FP6和FP7为简并引物扩增,第3轮引物SP2浓度为0.75~1.0μmol/L时,均有较好结果。
但从节约成本、提高条带清晰度、减少非特异性扩增角度考虑,0.75μmol/L时更佳。
3结论与讨论
3.1结论
从试验结果来看,FPNI-PCR适合以低浓度DNA为模板,第1轮反应以稀释后的DNA为模板,20μL体系中,用量在4.5~10ng。
对三色堇FPNI-PCR第3轮体系进行优化,最优反应体系是:
20μL反应体系中,特异性引物浓度0.2μmol/L,引物SP2浓度0.75μmol/L,TaqDNA酶用量10U,dNTP用量2μL,10×buffer(20mmol/L,Mg2+plus)用量2μL,模板为第2轮反应稀释100倍后取1μL,ddH2O补足。
第3轮反应经温度筛选,退火温度64℃或66℃时条带最佳。
3.2讨论
FPNI-PCR是基于热不对称PCR技术原理的PCR方法,共包括3轮PCR反应。
其中,第1轮反应中,含3次高严谨反应,目的是使高退火温度的特异性引物SP1与模板序列退火延伸;1次低严谨反应,目的是使简并引物结合到较多的目的序列上;5次热不对称的高低特异性循环交替反应,使目的片段得以指数性扩增。
第2、3轮为普通PCR反应,通过特异性嵌套引物进一步扩增目的条带。
它与普通TAIL-PCR的主要区别在于给出了经过优化后的一系列简并引物,并在简并引物的基础上设计了嵌套的特殊引物FSP1、FSP2用于第2、3轮的扩增[2]。
特异性嵌套引物的存在,使非目的条带得不到大量扩增,而非目标序列中的发卡结构也能抑制其扩增,从而提高了目的片段扩增的准确性[11]。
由于FPNI-PCR反应步骤较多,因此影响扩增结果的因素也较多。
首先,第1轮的高低严谨热不对称反应是目标片段扩增的最初环节,而本试验证明,模板浓度是影响第1轮反应结果的关键因素。
在研究中发现,低浓度的DNA模板更容易获得扩增结果,且模板DNA的稀释倍数对不同简并引物扩增的影响不同。
在其他PCR反应的研究中同样发现,植物DNA模板的浓度对于目的片段的扩增具有很大的影响[12]。
在TAIL-PCR中,通常需要对模板进行稀释,才能获得较为清晰的条带[4,13]。
原因可能是DNA中所含杂质的影响,未稀释的高浓度DNA中所含杂质更多,影响条带扩增,另外,不同简并引物对模板的浓度要求也可能不同,所适应的模板浓度存在差异。
在FPNI-PCR反应中,第1轮扩增产物因条带杂、浓度低,往往无法通过凝胶成像显示,需要通过第2轮对目标条带的进一步扩增获得初步结果。
通过第2轮产物凝胶成像,以有条带的第2轮稀释产物为模板,通过第3轮反应进一步扩增,以期获得较第2轮更为清晰的条带。
因此,第3轮反应体系的优化对最终结果的获得具有重要作用。
本研究中,针对第3轮PCR反应中部分因素进行了优化,结果发现,与buffer(Mg2+plus)、TaqDNA酶用量相比,引物的浓度影响最为显著,随着引物浓度的上升,条带数量、亮度明显增加。
需要注意的是,较高的引物浓度虽有利于扩增,但会造成条带模糊、非特异性条带增加,这与其他PCR反应类似[14],不利于与第2轮条带比对推测目的条带。
虽然FPNI-PCR中融合引物特殊且相对较短,有利于与DNA模板结合扩增目的条带,但经过3轮反应虽然在一定程度上降低了非特异条带的干扰,但杂条带的影响仍是影响试验结果的重要原因[15]。
因此,在第3轮反应中选出最适当的引物浓度,具有十分重要的作用。
含Mg2+的buffer缓冲液主要对引物和模板的退火、TaqDNA酶的稳定起作用,当缓冲液低于一定限度不能产生条带,但用量过多也会使dNTP过量结合,非特异性条带增加,不利于反应[16-17]。
与缓冲液相对应,TaqDNA酶用量的多少,同样对PCR反应存在直接影响,不同的Taq酶需要配合相应的缓冲液使用,过少无法产生条带,过多也会造成非特异性扩增[18-19]。
在本试验中,较高的buffer浓度和TaqDNA酶均有利于扩增。
PCR反应中除各因素外,退火温度对目的条带的获取同样具有重要作用。
相关研究发现,对热不对称PCR第3轮反应退火温度的优化,能有效地促进目的片段的富集[20]。
本试验第3轮PCR反应中,特异性引物的Tm值为65℃,通过温度筛选得出,退火温度为64℃或66℃时,条带更为清晰。
综上所述,本研究发现,在FPNI-PCR中通过优化反应体系中各因素的浓度或用量,筛选3轮PCR的退火温度,均能有效地增加目的条带的清晰度,减少非特异性扩增,为后续研究打下良好基础,为其他物种基因启动子的研究提供一定的借鉴作用。
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