引物设计大全.docx
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引物设计大全
primerpremier为主,primerexpress为辅(针对探针),Oligo来验证,BLAST随时检验
PCR引物设计原则
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。
如这一段不能形成二级结构,那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基,扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性,一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素、荧光素、地高辛等,这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰,因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位,因为密码子第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。
实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp,一般为20~27mer。
引物的有效长度:
Ln=2(G+C)+(A+T),Ln值不能大于38,因为>38时,最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断,引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性,尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。
3′端也不能有形成任何二级结构可能,除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中,引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中,用2UTaqDNA聚合酶和800μmol/LdNTP(四种dNTP各200μmol/L)以质粒(103拷贝)为模板,按95℃,25s;55℃,25s;72℃,1min的循环参数扩增HIV-1gag基因区的条件下,引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。
A∶A错配使产量下降至1/20,A∶G和C∶C错配下降至1/100。
引物A:
模板G与引物G:
模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。
因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。
引物5′端修饰包括:
加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。
寡核苷酸的优化设计
1.估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性
寡核苷酸,无论是DNA的或者RNA的,都有形成双链结构的潜在可能性,正如下面反复提到的,这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。
所以,预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。
在一个双链结构中,碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。
在热动力学中,这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。
现在,大多采用Breslauer等人提出的,以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。
为简化起见,所有的计算都在25℃条件下进行。
此时,最接近的相邻核苷酸的自由能是:
第一个(5′)核苷酸 第二个核苷酸
dA dC dG dT
dA -1.9 -1.3 -1.6 -1.5
dC -1.9 -3.1 -3.6 -1.6
dG -1.6 -3.1 -3.1 -1.3
dT -1.0 -1.6 -1.9 -1.9ΔG(kcal/mol)
例如,双链d(ACGG/CCGT)的ΔG是:
ΔG(ACGG)=ΔG(AC)+ΔG(CG)+ΔG(GG)=-(1.3+3.6+3.1)=-8.0kcal/mol
此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。
也可以用来计算发夹环结构的ΔG。
不过,这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。
如3个核苷酸时为5.2kcal/mol;4个时为4.5;5个为4.4;6个是4.3;7和8个为4.1kcal/mo1。
2.选择引物的一般规则
设计和选择引物时有5个要素必需注意。
2.1 引物的3′末端不互补 引物的3′末端一定不能有很大的互补性,因为它们的互补会形成引物二聚体,这就会带来很大的问题,例如合成出非专一的产物,极大地减少所期望产物的得量。
有实验表明,3′末端双链的ΔG是0~-2kcal/mol时,PCR产量几乎达到百分之百,随着其绝对值的增加产量逐渐下降,在-6时只有40%,到-8时少于20%,而-10时,接近于0。
虽然产量还取决于其他参数,如退火温度、引物的专一性等等,但是用Taq聚合酶操作时,由于它的工作能力很强,能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应,即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用,所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。
2.2 引物分子内不互补 应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。
虽然有些带有发夹环,其ΔG为-3kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果,但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦,即会引发引物内部的延伸反应,减少了参与正式反应引物的数量。
当然,如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。
2.3 引物的组分、解链温度和长度 普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。
其实,这是不对的。
以人基因组DNA为模板,用81%AT的引物可以产生单一的,专一的,长250bp,含有70%AT的产物。
完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度,PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。
要知道,更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。
差异越小,PCR的效率越高。
因为DNA的解链温度也取决于它的长度,所以有的研究者喜欢设计很长,而不求它很稳定的引物。
可是,引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补,因此,一般还是不用为好。
如果期待的产物长度等于或小于500bp,选用短的(16~18mer)的引物:
若产物长5kb,则用24mer的引物。
有人用20~23mer引物得到40kb的产物。
但是,引物较长时,如果不借助引物选择的计算机软件帮助,就很难确定一对引物是否会形成二聚体,是否有自身互补性以及专一性如何。
于是,用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板,得出非专一产物。
通过下述的观察内部稳定性原理可以极大地减少这种问题。
2.4 引物的内部稳定性 在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多),而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物,这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。
这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。
其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于,接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成,所以不会产生假产物。
因此,为了有效地引发反应,引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。
与此相反,带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对,只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应,产生非专一产物。
如果用3′末端低稳定性的引物,反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。
这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。
还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。
所以,有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。
但是,无论如何,寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于-9kcal/mol的,通常就是专一性的探针或引物。
寡核苷酸3′末端越不稳定,假引发的可能性越低。
2.5 引物的唯一性 为了放大单个的、专一性DNA片段,选用的引物序列就应当是唯一的,即在模板中没有重复序列。
虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹配,但是,通常见到的引物的3′末端往往都有6~7个没有什么个性的核苷酸。
如果假引发的位点正好在放大区的内部,那麻烦就大了。
由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率,就容易产生非专一产物。
如果用哺乳动物基因组序列作为模板,可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的引物的互补性。
由此也可知,应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。
3.按照氨基酸序列设计寡核苷酸
按照多肽的氨基酸序列来设计PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段,尤其是在试图“钓取”一个蛋白质的基因时。
此时要注意的问题有:
(1)宁可用简并引物,也不用猜测的引物。
氨基酸密码子的简并性给予引物设计以可塑性,这比用猜测的密码子要好得多。
有人用1024个简并引物得到很好的结果。
但是,应当避免在一个区域内有很高的简并性。
但也有简并性低使引物不工作的报道。
(2)引物与模板的错配。
一般认为,所用引物与模板有15%~20%的错配,PCR的效果还能接受。
但是,引物3′末端的错配比同样错配率的5′末端错配会引起更严重的问题。
在最后4个碱基中有2个错配的引物,其PCR产量急剧下降。
但是,当核苷酸浓度高时,3′末端有错配的引物还能被Tag聚合酶很好地利用。
在0.8mmol/L时,大多数3′末端错配引物可以接受,虽然非专一产物比较多,DNA合成的忠实性也下降。
即使在低核苷浓度下,还会有少量从错配碱基出发的合成,因此,在开始的PCR循环中把退火时间增加到3~5分钟,比之于用标准退火时间和高浓度核苷酸能够产生质量更好的所求产物。
(3)在用唯一性引物时,建议用0.2mmol/L或更低的总核苷酸浓度,因为高浓度会增加错误参入的比率。
(4)简并寡核苷酸时,PCR应当在比较高的引物浓度下进行,即1~3μmol/L而不是0.2μmol/L,因为在反应混合物中的大多数寡聚物并不是被用来引发专一的反应,而只是产生高的背景而已。
引物设计软件oligo应用简介
在专门的引物设计软件中,“Oligo”是最著名的。
它的使用并不十分复杂,但初学者容易被其复杂的图表吓倒。
Oligo5.0的初始界面是两个图:
Tm图和ΔG图;Oligo6.0的界面更复杂,出现三个图,加了个Frq图。
“Oligo”的功能比“Premier”还要单一,就是引物设计。
但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
oligo的下载和安装我就不多说了,打开oligo相信也无需多讲。
打开oligo的页面如下:
单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl+O”可打开下面的窗口
在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”
选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”
出现以下窗口,点击“window”再点击“Tile”
出现以下窗口,图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq,其中Frq是6.0版本的新功能,为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。
该频率高则可增加错误引发的可能性。
因为分析要涉及多个指标,起动窗口的cascade排列方式不太方便,可从windows菜单改为tile方式。
如果觉得太拥挤,可去掉一个指标,如Frq,这样界面的结构同于Oligo5.0,只是显示更清楚了。
∆G值反映了序列与模板的结合强度,最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高,而在3’端相对低(如图:
)Tm值曲线以选取72℃附近为佳,5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。
Frq曲线为“Oligo6”新引进的一个指标,揭示了序列片段存在的重复机率大小。
选取引物时,宜选用3’端Frq值相对较低的片段。
再点击Search再点“Fo'rPrimersandprobes”或使用快捷键F3
出现以下窗口,点OK就OK了。
当然你也可以点击“Prameters”和“SearchRange”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度。
出现SearchStatus窗口,点“OK”
出现Primerpairs窗口,#代表引物对的编号,依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量
点击任一行出现“PCR”窗口,告知你扩增片断的位置,最合适的退火温度等等信息。
关掉“PCR窗口”和“primerPairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置,图中手型鼠标所指即为引物序列。
至此引物设计已经完成,你可以用“Analyse”菜单分析你的引物:
有无引物二聚体、发卡结构等等。
当上下游引物全选好以后,需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。
首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。
需要注意的是,引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之间形成(crossdimer)。
二聚体形成的能值越高,越不符合要求。
一般的检测(非克隆)性PCR,对引物位置、产物大小要求较低,因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。
第二项检查是发夹结构(hairpin);与二聚体相同,发夹结构的能值越低越好。
一般来说,这两项结构的能值以不超过4.5为好。
当然,在设计克隆目的的PCR引物时,引物两端一般都添加酶切位点,必然存在发夹结构,而且能值不会太低。
这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果,对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。
第三项检查为GC含量,以45-55%为宜。
有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内,这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,以有利于退火温度的选择。
谢谢各位!
(完)
PrimerPremier5速成
.打开后的界面如图。
点FILE---NEW—DNASEQUENCE如图所示。
输入目的基因片段,可以复制后用ctrl+V键拷贝到栏内,后应加数个N以备后续设计时加酶切位点及保护碱基,如图所示。
选中enzyme图标,将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏
选中OK键,分析目的基因中所含的酶切位点,选插入位点时就应排除这些酶
选中primer图标,点S图标,editprimer,开始设计正义链。
软件默认引物为二五个碱基
可将鼠标点在设计框的3端从右向左删除7-9个碱基,保留16-18个配对即可
在引物的5端加入选好的酶切位点并在其左侧加3个保护碱基,入该图加入HINDIII酶切位点及TTA保护碱基,完成后点analyze,认为可以后点OK。
选中左上角A图标,用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。
如图,选中EDITPRIMERS图标,开始设计反义链。
从3端删除7-9个碱基同正义链。
将酶切位点加在5端,应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入(注意不要加反)
如图加入BamHI酶切位点及CGC3个保护碱基。
完成后点analyze,认为可以后点OK。
最后分析结果如图,反义链的FALSEPRIMING可以不考虑,RATING表示引物评分也可以
不考虑,主要看Tm值正义链和反义链相差不应超过3度。
GC含量不应超过60%
该软件有个缺点,不能保存分析结果,只能选择打印
如果设计RT-PCR检测的引物就如下所示。
同上输入目的基因片段,选SEARCH图标,选择
参数,一般选PCRprimers---both—100至250个碱基,引物长短20+/-2,searchparametere中的参数可以不选,为默认设置。
点OK。
显示满足设计参数的候选结果,点OK.
点SENES选择正义链,RATING表示引物评分,最好选评分高的。
点ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。
整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计相同
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