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以大肠杆菌(E.coli)为例,E.coli和其它原核细胞一样,只有一种RNA聚合酶,合成各种RNA。
一个E.coli细胞中约有7000个RNA聚合酶分子,在任一时刻,大部分聚合酶(5000个左右)正在参与RNA的合成,具体数量依生长条件而定。
E.coliRNA聚合酶全酶(holoenzyme)分子量460000Da,由五种、六个亚基组成,α2、β、β'
、σ、ω,另有两个Zn2+。
无σ亚基的酶叫核心酶,核心酶只能使已开始合成的RNA链延长,而不具备起始合成活性,加入σ亚基后,全酶才具有起始合成RNA的能力,因此,σ亚基称为起始因子。
不同的细菌α、β、β'
亚基分子量变化不大,但σ亚基分子量从44000Da~92000Da。
σ亚基的功能能使核心酶在DNA上滑动,让核心酶与DNA启动子更容易结合,增加停留时间,使聚合酶迅速找到启动子并与之结合,σ亚基本身无催化活性,但不同的σ因子能识别不同的启动子,从而表达不同的基因。
不同的原核生物,都具有相同的核心酶,但σ亚基有所差别,这决定了原核基因表达的选择性。
RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板,转录时DNA的双链结构部分解开,转录后DNA仍然保持双链的结构。
核心酶覆盖60bp的DNA区域,其中解链部分17bp左右,RNA-DNA杂合链约12bp。
37℃时,原核RNA聚合酶的聚合速度可达50个核苷酸/秒。
表10-3E.coliRNA聚合酶各亚基性质及功能
亚基
基因
分子量
亚基数
功能
α
rpoA
40000
2
酶的装配及结合启动子上游元件和活化因子
β
rpoB
155000
1
结合核苷酸底物,催化磷酸二酯键形成
β'
rpoC
160000
与模板DNA结合
σ
rpoD
32000-92000
识别启动子,促进转录起始
ω
未知
9000
2、真核生物RNA聚合酶
真核细胞中已发现三种RNA聚合酶,分别称为RNA聚合酶I、II、III,RNA聚合酶I转录rRNA,RNA聚合酶II转录mRNA,RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。
这三种RNA聚合酶分子量都在50万左右,亚基数通常有8-14个。
动物、植物、昆虫等不同来源的细胞,RNA聚合酶II的活性都可被低浓度的α-鹅膏蕈碱抑制,而RNA聚合酶I不受抑制。
动物RNA聚合酶III受高浓度的α-鹅膏蕈碱抑制,而酵母、昆虫的RNA聚合酶III不受抑制。
α-鹅膏蕈碱是一种毒蕈(鬼笔鹅膏Amanitaphalloides)产生的八肽化合物,对真核生物RNA聚合酶有较大毒性,但对原核生物RNA聚合酶只有微弱抑制作用。
除了细胞核RNA聚合酶外,还分离到线粒体和叶绿体RNA聚合酶,它们的结构简单,能转录所有种类的RNA,类似于细菌RNA聚合酶。
3、噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶
仅为一条分子量11000Da的多肽链,这些聚合酶只识别噬菌体DNA的少数启动子,并无选择地与其作用,37℃时的聚合速度200碱基/秒。
二、转录过程
RNA的转录过程可分为起始、RNA链的延长及终止三个阶段,转录起始前需要相关的转录因子共同作用。
(一)原核生物基因转录的起始
首先RNA聚合酶的σ因子辨认DNA的启动子部位,并带动RNA聚合酶的全酶与启动子结合,形成复合物。
RNA聚合酶可以“挤”入DNA双螺旋结构之内,起到解旋作用,并使DNA的局部结构松弛,解开约10几个碱基对长的DNA双链形成转录泡,暴露出DNA模板链。
与复制不同的是,RNA聚合酶可以开始新RNA链合成,因此转录起始不需要引物。
RNA聚合酶进入起始部位后,直接催化NTP,使其与模板链上相应的碱基配对(U-A,A-T,G-C),并结合到DNA模板链上,形成第一个磷酸二酯键。
第一个核苷酸以GTP最常见,与第二个核苷酸结合后GTP仍保留5’-端三个磷酸,形成RNA聚合酶全酶-DNA-pppGpN-OH-3’复合物,称为转录起始复合物。
RNA链开始合成后,σ因子从复合物上脱落,核心酶进一步合成RNA链。
σ因子可以反复使用,它可与新的核心酶结合成RNA聚合酶的全酶,起始另一次转录过程。
(二)RNA链的延长
RNA链的延长反应由核心酶催化。
核心酶沿模板DNA链向下游方向滑动,每滑动一个核苷酸的距离,则有一个核糖核苷酸按DNA模板链的碱基互补关系进入模板,即U-A、A-T、C-G,形成一个磷酸二酯键,如此不断延长下去。
与DNA复制一样,RNA链的合成也是有方向性的,即从5’端→3’端进行。
DNA链在核心酶经过后,即恢复双螺旋结构,新生成的RNA单链伸出DNA双链之外。
原核细胞与真核细胞的转录延长过程基本相似。
图10-13表示转录过程。
(三)转录的终止
图10-13原核生物转录过程
细菌和真核生物转录一旦开始,通常都能继续下去,直至转录完成而终止,DNA中有一段特殊序列,能提供转录停止信号,称为终止子(terminatorT),
而协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子称为终止因子(terminationfactor),有些终止子的作用可被特异的因子所阻止,使酶越过终止子继续转录,称为通读,这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子(antiterminationfactor)。
终止子位于已转录的序列中,DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。
1.原核生物中的两类终止子
(1)不依赖于ρ因子的终止子
这类终止子在DNA模板上靠近终止处有些特殊的碱基序列,即较密集的A-T配对区或G-C配对区的回文序列,其转录产物3’-端终止区能形成发夹结构,转录终点有4~6个寡聚U。
这种发夹样二级结构使RNA聚合酶不再向下游移动,自动脱离模板,转录终止。
(2)依赖ρ因子的终止子这类终止子必需依赖ρ因子的协助才能终止转录,ρ因子是一种分子量46000Da的蛋白,能识别并结合RNA产物3’-端上游富含C的特异序列,发挥其ATP酶活性水解ATP释出的能量,使核心酶构象改变停止转录。
同时,ρ因子还具有解旋酶活性,能使RNA-DNA杂交双链螺旋解开,释放核心酶、ρ因子、RNA产物。
释放的核心酶可以与σ因子重新结合,形成RNA聚合酶全酶,参与另一次转录过程。
图10-14示原核生物终止子结构。
有关真核生物的终止机制知之甚少,其中,RNA聚合酶I转录出rRNA基因后,继续向下游转录出超过1000个碱基,此处有一个18bp的终止序列,在辅助因子协助下终止转录。
图10-14终止子模型
RNA聚合酶II的转录没有明确终止信号,转录通过结构基因的结尾后,还要向下继续转录几千的碱基,没有固定的终止点。
RNA聚合酶III转录模板的下游有终止子,该终止子位于富含GC序列中的TTTT上,因此RNA聚合酶III催化的RNA前体3'端有U序列。
转录过程是基因表达的中心环节,转录起始与终止的控制在基因表达的调控中起着重要作用,某些抗生素,如利福霉素、利链菌素能抑制细菌RNA聚合酶活性,因而抑制细菌RNA的合成。
这正是此类抗生素抑菌作用的机理。
(四)转录的调控
基因表达受到各个方面的调控,其中转录环节的调控是最重要的环节,尤其是原核生物,转录和翻译几乎同时进行,转录水平的调控就显得更为重要。
转录是在DNA模板上特殊位点开始的,该位点能被RNA聚合酶识别、结合并开始转录,这段必需的DNA序列称为启动子(promoter),又称启动基因。
同时,RNA聚合酶在进行转录时,常需要一些辅助因子(蛋白质)参与作用,此类蛋白质统称为转录因子。
在DNA模板链上,从起始点逆转录方向的区域称为上游,顺转录方向的区域叫下游,转录起始点的碱基以+1表示,下游就是+2、+3、+4……+n,上游以-1、-2、-3、-4……-n表示。
1、原核生物的转录调控
(1)原核生物启动子的结构与功能
分析比较上百种原核生物启动子序列,发现不同的启动子都存在保守的共同序列,包括RNA聚合酶识别位点和结合位点,其中主要的有-10序列(Pribnow框)和-35序列(Sexfamabox,识别区域)。
①在转录起点上游大约-10处,有一个6bp的保守序列TATAAT,称Pribnow框。
此段序列出现在-4到-13bp之间,每个位点的保守性在45%-100%。
频度:
T89A89T50A65A65T100。
Pribnow框中,头两个碱基TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。
目前认为,Pribnow框决定转录方向。
酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物,Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开,形成开放型起始结构,它是RNA聚合酶牢固的结合位点,是启动子的关键部位。
②在-35位置有一个6bp的保守序列TTGACA,是RNA酶的识别区域,其中TTG十分保守,各碱基出现频率如下:
T85T83G81A61C69A52,。
-35序列是原核RNA聚合酶中的σ因子识别位点。
因此,-35序列对RNA聚合酶全酶有很高的亲和性。
-35序列的核苷酸结构,在很大程度上决定了启动子的强度,RNA聚合酶易识别强的启动子。
-35序列提供RNA聚合酶识别信号,-10序列有助于DNA局部双链解开,启动子结构的不对称性决定了转录的方向,如图10-14。
(2)操纵子模型解释了原核生物基因调控的机制
法国分子生物学家Jacob和Monod对大肠杆菌(E.coli)酶产生的诱导和阻遏现象进行研究后提出了操纵子模型(operonstructuralmodel)来解释转录调控,该研究发现,在葡萄糖和乳糖都存在的培养基中,大肠杆菌不能利用乳糖,只有乳糖单独存在时才能利用乳糖。
乳糖操纵子是大肠杆菌中控制β半乳糖苷酶诱导合成的操纵子,包括调控元件P(启动子)和O(操纵基因),以及结构基因lacZ(编码半乳糖苷酶)、lacY(编码通透酶)和lacA(编码硫代半乳糖苷转乙酰基酶)。
如图10-15所示
图10-15E.coli乳糖操纵子模型
当培养基中没有乳糖时,操纵子上游的调节基因i编码的调控蛋白结合到操纵基因O上,阻止了RNA聚合酶不能往下游移动,导致结构基因lacZ、lacY、lacA不能转录表达代谢乳糖的酶。
如图10-16所示
当只有乳糖存在时,乳糖可与调节基因i编码的调控蛋白结合,而使调控蛋白失效,不能与操纵基因结合,RNA聚合酶能往下游移动使结构基因结构基因lacZ、lacY、lacA转录,翻译出代谢乳糖的酶以代谢乳糖。
如图10-17所示
图10-17乳糖阻遏调控蛋白
当葡萄糖和乳糖同时存在时,不能利用乳糖的原因是在乳糖操纵子的调控中,有降解物基因活化蛋白(CAP)产生,CAP首先与cAMP形成复合物,此复合物才能与启动子相结合而促进结构基因转录,且游离的CAP不能与启动子结合,必须在细胞内有足够的cAMP时才行,但葡萄糖的降解产物能降低cAMP含量,所以影响CAP-cAMP复合物与启动基因结合,抑制结构基因转录,此时即使有乳糖存在,但仍不能利用乳糖。
2.真核生物转录调控
真核生物转录调控过程复杂,不组成操纵子来调控,大多数真核生物启动子以正调控为主,依靠顺式作用元件(cis-actingelement,指DNA上对基因表达在调节活性的某些特定的调控序列,其活性仅影响其自身处于同一DNA分子上的基因)和反式作用因子(trans-actingfactor,通过直接结合或间接作用于DNA、RNA等核酸分子,对基因表达调节作用的各类蛋白质因子)来协同调控的。
(1)真核生物有三种RNA聚合酶对应三类启动子,RNA聚合酶I结合的是I类启动子,含I类启动子的基因主要是rRNA,这类基因有上千个拷贝,人的rRNA基因的启动子包括核心元件和上游调控元件,分别位于-45至+20,后者位于-156至-107,两个原件都富含GC碱基对,两个原件之间的距离很重要,过长或过短都会降低转录起始效率。
由RNA聚合酶II结合的启动子叫II类启动子,分别有TATA盒(Hogness盒),中心在-25至-30,长度7bp左右。
碱基频率:
T82A97A85A63(T37)A83A50(T37)。
此序列能被RNA聚合酶II识别,使DNA双链解开,并决定转录的起点和方向。
还有CAAT盒,中心在-75处,9bp,共有序列GGT(G)CAATCT,能被RNA聚合酶识别并结合。
还有GC盒,在CAAT盒上游,序列GGGCGG,与某些转录因子结合。
如图10-12所示
由RNA聚合酶III结合的启动子叫III类启动子,含有III类启动子的基因包括5SrRNA、tRNA等基因。
其中tRNA基因的启动子包括A盒和B盒两部分,分别位于+10至+20,+50至+60的区域。
(2)增强子是指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。
在SV40的转录单元上发现,位于转录起始点上游约200bp处的两段72bp正向重复序列。
增强子效应十分明显,一般能使基因转录频率增加10-200倍,并且增强效应与其位置和取向无关,不论增强子以什么方向排列(5’→3’或3’→5’),甚至和靶基因相距3kb,或在靶基因下游,均表现出增强效应;
大多为重复序列,一般长约50bp,适合与某些蛋白因子结合。
其内部常含有一个核心序列:
(G)TGGA/TA/TA/T(G),该序列是产生增强效应时所必需的;
没有基因专一性,可以在不同的基因组合上表现增强效应;
(3)沉默子是某些基因含有的负性调节元件,当其结合特异蛋白因子时,对基因转录起阻遏作用。
(4)反式作用因子是能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件上,参与调控靶基因转录的蛋白质,也称为转录因子(transcriptionalfactor,TF)。
如转录因子TFⅡD能识别结合TATAbox;
转录因子SP1识别结合GCbox;
转录因子CTF1识别结合CAATbox。
反式作用因子的类型分为基本转录因子(通用转录因子)和细胞特异性转录因子,前者又称TATA盒结合蛋白,如TFⅠ、TFⅡ和TFⅢ等。
细胞特异性转录因子包括EF1因子,作用于红细胞、Isl-I因子作用于胰岛β细胞、MyoDI因子作用骨骼肌细胞、NF-κB因子作用于B淋巴细胞、DF3因子作用于乳腺癌细胞。
此外还有可诱导的转录因子如高温诱导的热休克转录因子(HSTF);
抗原诱导的CD28反应元件结合蛋白;
感染与炎症诱导的激活蛋白2(AP-2)等。
反式作用因子有两个必需的结构域:
DNA结合结构域和转录激活结构域,前者包括螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix);
锌指结构(zincfinger);
亮氨酸拉链(leucinezipper,ZIP);
螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)。
三、转录后的加工与修饰
转录生成的RNA初级产物是RNA的前体,它们没有生物学活性。
通常还需要经过一系列加工修饰过程,才能最终成为具有功能的成熟RNA分子。
细菌中RNA转录后加工相对较为简单,由于不存在核膜,通常RNA转录尚未结束翻译
即已开始。
真核细胞中几乎所有转录的前体都要经过一系列酶的作用,进行加工修饰,才能成为具有生物功能的RNA。
(一)mRNA的加工
mRNA通过转录作用获得DNA分子中储存的遗传信息,可以再通过翻译作用将其信息传到蛋白质分子中,它是遗传信息传递的中介物,具有重要的生物学意义。
真核细胞的mRNA前体是核内分子量较大而不均一的hnRNA,mRNA由hnRNA加工而成。
加工过程包括5’-端和3’-端的首尾修饰及剪接。
1.5’-端加帽mRNA的5’-端帽子结构是在hnRNA转录后加工过程中形成的。
转录产物第一个核苷酸常是5’-三磷酸鸟苷(5’-pppG),在细胞核内的磷酸酶作用下水解释放出无机焦磷酸,然后,5’-端与另一GTP反应生成三磷酸双鸟苷,在甲基化酶作用下,第一或第二个鸟嘌呤碱基发生甲基化反应,形成帽子结构(5’-m7GpppGp,或5’-GpppmG)。
该结构的功能可能是翻译过程中起识别作用,并能稳定mRNA,延长半衰期。
2.3’-端加多聚腺苷酸尾mRNA分子的3’-末端的多聚腺苷酸尾(polyAtail)也是在加工过程中加进的。
在细胞核内,首先由特异核酸外切酶切去3’-端多余的核苷酸,再由多聚腺苷酸聚合酶催化,以ATP为底物,进行聚合反应形成多聚腺苷酸尾。
polyA长度为20~200个核苷酸,其长短与mRNA的寿命有关,随寿命延长而缩短。
polyA尾与维持mRNA稳定性、保持翻译模板活性有关。
3.剪接hnRNA在加工成为成熟mRNA的过程中,约有50%~70%的核苷酸链片段被剪切。
真核细胞的基因通常是一种断裂基因(interruptedgene),即由几个编码区被非编码区序列相间隔并连续镶嵌组成。
在结构基因中,具有表达活性的编码序列称为外显子(exon);
无表达活性、不能编码相应氨基酸的序列称为内含子(intron)。
在转录过程中,外显子和内含子均被转录到hnRNA中。
在细胞核中,hnRNA进行剪接,即切掉内含子部分,然后将各个外显子部分再拼接起来(图10-18)。
图10-18mRNA前体的剪接
(二)tRNA的加工
1.剪切
在真核细胞中,tRNA前体分子的5’-端、3’-端及反密码环的部位由核糖核酸酶切去部分核苷酸链而形成tRNA。
有些前体分子中还包含几个成熟的tRNA分子,在加工过程中,通过核酸水解酶的作用而将它们分开。
2.加CCA-OH的3’-端
tRNA分子在转录后由核苷转移酶催化,以CTP和ATP为供体,氨基酸臂上的3’末端添加-CCA-OH结构,从而具有携带氨基酸的功能。
3.碱基修饰
在tRNA的加工过程中,由修饰酶实现碱基的修饰。
例如,碱基的甲基化反应产生甲基鸟嘌呤(mG)、甲基腺嘌呤(mA),还原反应使尿嘧啶转变成二氢尿嘧啶(DHU),脱氨基反应使腺嘌呤转变为次黄嘌呤(I),碱基转位反应产生假尿苷(Ψ)等。
故成熟的tRNA分子中拥有多种稀有碱基。
(三)rRNA的加工
rRNA的转录和加工与核糖体的形成同时进行。
真核细胞在转录过程中首先生成的是45S大分子rRNA前体,然后通过核酸酶作用,断裂成28S、5.8S及18S等不同rRNA。
这些rRNA与多种蛋白质结合形成核糖体。
rRNA成熟过程中也包括碱基的修饰,碱基的修饰以甲基化为主。
三类RNA通过链的剪切、拼接、末端添加核苷酸、碱基修饰等加工过程转变为成熟的RNA,后者再参与蛋白质的生物合成等功能。
本章小结
DNA复制是指以亲代DNA为模板合成子代DNA将遗传信息准确的从亲代DNA传递给子代DNA的过程。
基因通过转录和翻译,合成了各种功能性蛋白质,合成过程即基因表达的过程。
复制→转录→翻译,为中心法则的经典内容。
DNA复制的方式为半保留复制,复制体系包括模板、底物、酶和蛋白质因子、RNA引物等多种物质。
酶和蛋白质因子包括解旋酶、拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。
DNA聚合酶Ⅲ是大肠杆菌DNA复制最主要的酶。
复制的过程可大体分为起始、延长和终止三个阶段。
针对已发生了的DNA缺陷进行修复称为DNA修复,修复方式有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复等多种。
切除修复是人体细胞修复DNA损伤的主要方式。
某些病毒遗传信息储存在RNA分子中,能以RNA为模板合成DNA,称为逆转录。
转录是指以某段DNA分子的单链为模板,合成与其互补的RNA分子,将DNA的遗传信息传递给RNA的过程。
参与RNA合成的成分有多种,包括DNA模板、四种三磷酸核糖核苷(NTP)原料、RNA聚合酶、某些蛋白质因子、无机离子等。
大肠杆菌RNA聚合酶由σ因子与核心酶构成,σ因子辨认DNA模板上的启动子,协助转录的起始,启动子是一段特殊的核酸序列,包括RNA聚合酶识别位点和结合位点,其中主要的有-10序列(Pribnow框)和-35序列(Sexfamabox,识别区域);
真核生物的转录启动较为复杂,三种RNA聚合酶分别识别三类启动子。
E.coli转录的终止分为依赖于ρ因子的终止和不依赖于ρ因子的终止,真核生物的终止则研究较少,比较复杂。
转录是基因表达调控最主要的方式,原核生物的乳糖操纵子模型能说明基因表达调控的基本方式。
真核生物的调控依靠顺式作用元件和反式作用因子来调控,前者如启动子、增强子、沉默子,后者包括一些转录结合蛋白类。
核心酶使已经开始合成的RNA链延长。
真核细胞RNA聚合酶Ⅱ催化mRNA的前体——hnRNA的合成,是真核生物中最重要的RNA聚合酶。
本章主要考点
基本概念:
复制、转录、翻译、逆转录、基因表达、半保留复制。
遗传信息传递的中心法则。
复制与转录的体系与特点。
参与复制的酶和蛋白质因子的作用。
DNA修复的方式。
RNA聚合酶的特点。
转录调控相关的作用机制。
mRNA的加工过程。
(王雨辰)
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