流式细胞术及其科研应用.ppt

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流式细胞术流式细胞术及其科研应用及其科研应用流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术（流式细胞术（FlowCytometry,FlowCytometry,简称简称FCMFCM）是一种可是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选对特定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等成微球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量定量BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞术的特点流式细胞术的特点v极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（流式细胞仪（FlowcytometerFlowcytometer）可以每秒钟数十、数百、数）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

乃至数百万个。

v可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。

群的识别、计数更为准确。

v定性或定量分析细胞：

通过荧光染色对单细胞的某些成分如定性或定量分析细胞：

通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNADNA含量、抗原或受体表达量、含量、抗原或受体表达量、CaCa2+2+浓度、酶活性以及细胞的浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析v强大的分选功能，在分析的强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选同时可以对特定群体加以分选BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小细胞大小=细胞粒度细胞粒度=细胞表面面积细胞表面面积=核浆比例核浆比例=DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期=RNARNA含量含量=蛋白质含量蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面细胞表面/胞浆胞浆/核的特异核的特异性抗原性抗原=细胞活性细胞活性=细胞内细胞因子细胞内细胞因子=酶活性酶活性=激素结合位点激素结合位点=细胞受体细胞受体BDBiosciencesImmuneFunction当前流式细胞分析发展趋势当前流式细胞分析发展趋势v从相对细胞计数到绝对细胞计数从相对细胞计数到绝对细胞计数v从相对定量到绝对定量分析从相对定量到绝对定量分析v从单色到多色荧光分析从单色到多色荧光分析v从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞膜成分到细胞内成分分析v从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析BDBiosciencesImmuneFunction散射光信号散射光信号RightAngleLightDetectorCellComplexitySSCForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSCIncidentLightSource=前向角散射光（前向角散射光（FSC,ForwardScatterFSC,ForwardScatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积=侧向角散射光（侧向角散射光（SSC,SideScatterSSC,SideScatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性细胞粒度及细胞内相对复杂性LaserFALSSensorBDBiosciencesImmuneFunction外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的检测信号流式细胞仪的检测信号荧光信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量BDBiosciencesImmuneFunction荧光信号荧光信号双色直接染色双色直接染色BDBiosciencesImmuneFunction数据分析数据分析=直方图分析直方图分析BDBiosciencesImmuneFunction数据分析数据分析=点图分析点图分析BDBiosciencesImmuneFunction数据分析数据分析=等高图和密度图分析等高图和密度图分析BDBiosciencesImmuneFunction数据分析数据分析=三维图分析三维图分析流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用BDBiosciencesImmuneFunction临床研究临床研究:

血液、肿瘤、药理、免疫.生物学研究：

生物学研究：

遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物、.环境研究：

环境研究：

海洋生态研究.制药工业制药工业食品工业食品工业农业畜牧业农业畜牧业流式细胞仪的应用领域流式细胞仪的应用领域BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用（免疫免疫）淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析CD4CD4绝对计数绝对计数HIVHIV的诊断与研究的诊断与研究淋巴细胞淋巴细胞CD4/CD8CD4/CD8分析分析CD4CD4绝对计数绝对计数TT细胞活化细胞活化细胞移植的交叉配型和免疫状态监测细胞移植的交叉配型和免疫状态监测免疫功能和免疫调控的研究免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化检测淋巴细胞和单核细胞的活化检测细胞因子的检测细胞因子的检测HLA-B27HLA-B27检测检测BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用（血液血液）白血病和淋巴瘤免疫分型白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病残留白血病造血干细胞计数造血干细胞计数PNHPNH诊断诊断网织红细胞分析网织红细胞分析血小板分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达血小板膜糖蛋白分子的表达血小板活化血小板活化网织血小板分析网织血小板分析BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用（肿瘤肿瘤）细胞周期分析细胞周期分析uDNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志志u在在L&L病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息uDNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待非整倍体的交界瘤应按恶性对待u形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能uDNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标多药耐药基因的检测多药耐药基因的检测BDBiosciencesImmuneFunction流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用=树突细胞研究树突细胞研究=干细胞研究干细胞研究=细胞凋亡细胞凋亡=细胞动力学功能研究细胞动力学功能研究=环境微生物分析环境微生物分析=流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术与分子生物学研究BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为BB淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），与体液免疫有关），与体液免疫有关TT淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），与细胞免疫有关），与细胞免疫有关总总TT和总和总BB可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病NKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能），行使免疫监控功能，能能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。

作用。

BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，TT淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为TT辅助辅助/诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）TT抑制抑制/细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/TsTh/Ts评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHDGVHD的攻击的攻击Th/TsTh/Ts升高：

自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、升高：

自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLESLE）Th/TsTh/Ts降低：

病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血降低：

病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血BDBiosciencesImmuneFunction常见疾病的常见疾病的TT淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化：

疾病疾病CD4+CD8+CD4+/CD8+类风湿性关类风湿性关节炎节炎（活动期）（活动期）系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮-或或（活动期）（活动期）多发性硬化症多发性硬化症重症肌无力重症肌无力膜型肾小球肾炎膜型肾小球肾炎胰岛素依赖性糖尿病胰岛素依赖性糖尿病乙型肝炎乙型肝炎自身溶血性贫血自身溶血性贫血上呼吸道感染上呼吸道感染BDBiosciencesImmuneFunction常见疾病的常见疾病的TT淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+肿瘤肿瘤再障及粒细胞减少症再障及粒细胞减少症巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染血小板减少血小板减少活动性特应性皮炎活动性特应性皮炎过敏性皮炎过敏性皮炎BDBiosciencesImmuneFunction淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析12%76%49%26%11%BDBiosciencesImmuneFunctionAIDS病人病人T亚群分析亚群分析27-51%15-44%50-84%BDBiosciencesImmuneFunction先天性无先天性无r球蛋白血症球蛋白血症5-18%淋巴细胞淋巴细胞活化功能研究活化功能研究BDBiosciencesImmuneFunctionT淋巴细胞活化淋巴细胞活化细胞数目增殖细胞数目增殖细胞表面表达细胞表面表达活化标记活化标记分泌细胞因子分泌细胞因子BDBiosciencesImmuneFunctionT细胞激活抗原表达的动力学曲线细胞激活抗原表达的动力学曲线BDBiosciencesImmuneFunction活化的淋巴细胞分泌细胞因子活化的淋巴细胞分泌细胞因子FastImmuneAssaySystem快速全面检测淋巴细胞功能快速全面检测淋巴细胞功能BDBiosciencesImmuneFunctionBDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统快速免疫活化检测系统lymphocyteActivation4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulusBDBioscienc