质粒DNA的提取定量酶切与PCR鉴定实验报告之欧阳法创编Word格式文档下载.docx
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二、实验原理
1.PCR(多聚酶链式反应)
在DNA聚合酶催化下,可以DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以dNTP为原料,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外(缓冲液中)复制DNA,使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反应步骤为:
A.变性:
加热反应系统至95℃,使模板DNA在高温下完全变性,双链解链。
B.退火:
逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温(35-70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右),与模板DNA互补退火形成部分双链。
C.延伸:
溶液反应温度升至中温72℃,在Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备
(1).碱裂解法:
染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异:
A.高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA均变性;
B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱:
A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质;
B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;
C.低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法):
A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性;
B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:
DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰
蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰
碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰
C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度;
A260/A280=1.8DNA纯净
A260/A280<
1.8表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质
A260/A280>
1.8含RNA杂质,用RNA酶去除。
4.质粒DNA的酶切鉴定:
限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的基本工具。
限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合,或是与其附近的特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳:
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:
不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).
三、材料与方法:
(一)实验材料:
1.PCR
仪器:
PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管
材料:
菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2×
PremixTaq、引物
2.质粒DNA的提取与制备
恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管
溶液P1(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去蛋白液PE(W1)漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α
3.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)
比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪
蒸馏水、质粒DNA
4.质粒DNA的酶切鉴定
1.5ml的EP管、微量加样枪
无菌水、10×
M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)
5.琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳系统、凝胶成像系统
电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液
(二)实验方法
3.质粒DNA的定量(紫外分光光度法)
四、结果与讨论:
(一)实验现象
1.加入溶液P1,出现悬浮现象;
2.加入溶液P2,温和混匀,溶液会变得清亮;
3.加入溶液P3,有白色絮状沉淀生成;
4.电泳时,可观察到在电流作用下,点样的溶液出现电泳现象,电泳速度不同。
在紫外检测仪条件下,可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。
(二)实验结果
原始实验数据
测量次数质粒DNA浓度(ug/ml)Ratio比值(A260/A280)
11481.46
21061.52
31151.45
平均值1231.47
电泳后的图片
(四)实验分析
1.由上数据可知,Ratio=1.47
1.8表明样品中含有较多的蛋白质(芳香族)
2.在图片中,其他三类DNA与Maker相比较,可知质粒DNA的分子大小在2500bp-3500bp,酶切反应的质粒DNA片段分子大小在2800-3000bp和400-500左右,PCR的DNA分子大小在400-500bp。
基本符合预期。
(四)实验讨论
1.质粒DNA中出现三条带,分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。
这三种不同构型的分子有不同的迁移率,在一般情况下,迁移速度最快的为超螺旋型,其次为线性分子,最慢的为开环状分子,所以条带从上到下分别为:
超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。
2.对于实验结果中:
1.8的可能原因为:
A.在质粒DNA的提取实验的“取上清液”步骤中吸入沉淀导致引入较多的蛋白杂质,进而导致后续实验中因蛋白质量较多而难以去除。
B.可能为试剂污染引起杂质蛋白的引入。
3.实验中需注意的事项:
用微量加样枪加试剂时,同种试剂可以不用换吸头,每次换不同试剂时要记得换一个新吸头。
在PCR中,如果配好的反应液较多沾到管壁上,要将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心,使反应液集中于管底,然后才将反应管放到基因扩增仪上。
在质粒DNA提取的实验中,加入溶液S2时,时间不能太久,动作要温柔,轻轻颠倒几次。
在电泳实验中,点样时枪头下伸,点样孔内不能有气泡。
在电泳中,Geldview有毒,切勿用手接触。
思考题:
(1)碱裂解法提取质粒时,溶液I、II、III的作用分别为?
答:
溶液I:
螯合金属离子,抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用;
有利于溶酶体的作用。
溶液II:
细胞壁肽聚糖在碱性下水解,核酸和蛋白质变性。
溶液III:
酸性条件下质粒DNA复性,变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀,Na+可中和DNA。
(2)结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率?
①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
②酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积,而且最大反应体系最好不要小于20ul,且酶切反应中甘油浓度应低于5%。
③底物DNA的纯度:
主要污染DNA的某些物质,如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应尽量纯化底物。
④反应系统:
主要是反应缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,合适离子强度可以激发酶切反应。
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