菌种的复苏传代及保存标准程序Word格式文档下载.docx

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1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。

1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。

1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。

1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将

冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。

用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。

1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。

1.1.2.7取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，需要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。

如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。

1.2为包管工作用菌株的传代次数不超出5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保管，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存收藏。

1.2.1准备：

①冻存呵护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。

②细菌冻存液：

由液体培养基与冻存呵护液按1：

1比例混匀制成。

1.2.2按1.1.2.1~1.1.2.4操纵，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。

1.2.3按1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。

标明菌名、编号及冻存日期等。

置-20℃或-80℃条件下冷冻保管。

1.2.4制备第2代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第1代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按1.2.3冻存。

1.3冻存菌悬液的复苏：

1.3.1准备：

灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。

根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基10ml、硫乙醇酸盐流体培养基12ml或改良马丁培养基10ml等）、琼脂斜面或平板培养基。

75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。

1.3.2操纵：

1.3.2.1从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。

1.3.2.2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。

1.3.2.3用75%酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁，稍干。

1.3.2.4点燃酒精灯，在火焰旁打开菌种冻存管盖，用一支灭菌滴管吸取解冻的菌悬液，接种至10ml液体培养基中（生孢梭菌需接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中）。

或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培养基上。

1.3.2.5将用过的滴管和菌种管投入消毒液内浸泡，接种环在火焰上灼烧。

1.3.2.6将上述接种后的培养基在规定温度下培养（细菌在30~35℃恒温培养18-24小时，真菌在23~28℃恒温培养24-48小时，黑曲霉*培养5~7天）。

1.3.2.7仔细观察培养物：

如呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种，注明菌名、编号、代次和接种日期后，置2~8℃冰箱内保管；

如发现菌苔形状不典型，可进行平板分离单菌落。

1.3.2.8注意：

已解冻的冻存管不成再冻存。

2.菌种的接种、传代

2.1.准备

接种环、酒精灯。

营养琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜的液体培养基。

培养基应新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。

75%酒精、0.1%新洁尔灭或84消毒液。

④菌种：

根据2010年版《中国药典》的要求，传代次数（n）应不超出4代。

2.2将冰箱中取出的菌种斜面，在室温放置30分钟，待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。

2.3点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜向上，

两试管口平齐靠近火焰旁。

2.4用右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易拔取，再以右手持接种环在火焰上烧红30秒钟，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3次。

2.5右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔出棉塞，夹在无名指、小指及掌部，并勿使其与任何物品接触。

2.6将灼烧过的接种环拔出菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，取出时，接种环不克不及通过火焰，应在火焰旁迅速拔出至接种管内液体培养基中，或在琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的概况曲折移动，使细菌划在斜面的概况上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。

2.7取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁将试管棉塞塞上，然后将接种过细菌的接种环在火焰上灼烧灭菌。

2.8已接种毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+1）和接种日期，细菌管置30~35℃培养18~24小时；

真菌管一般置23~28℃培养24~48小时（黑曲霉需培养5~7天）。

2.9培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形态，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。

需要时涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种。

如发现菌苔形状不典型，可继续进行平板划线培养，分离单菌落，挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上，代替原有的工作用菌种。

2.10检查合格的工作用菌种，放入冰箱内2~8℃保管，一般1个月转种一次。

2.11菌种（第n代）接种至适宜培养基中，在规定的温度条件下的培养物，即为第n+1代。

注意：

黑曲霉*致病性很强，操纵时应特别注意：

①黑曲霉孢子相当稳定，其在0.9%氯化钠溶液中，4℃左右的条件下可以保管较长的时间，故可将此孢子悬液作为储备液在1~2月内使用，以减少反复操纵的风险性。

②为防止黑曲霉孢子的传播，接种传代时应关闭风机，近酒精灯操纵。

③若传代的母代菌种为菌悬液，则用无菌吸管吹吸管内液体，取1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7日。

④接种传代时，改良马丁斜面必须是干燥的，否则影响其孢子的形成。

⑤接种传代后，使用过的器具均需在121℃，30分钟高压灭菌后再作处理。

3.菌种的保管：

3.1菌悬液冻存法：

冻干菌种（0代）复苏后，可按上述方法制备第1代菌悬液、第2代菌悬液进行冻存。

3.2琼脂斜面低温保管法：

日常使用的工作用菌种可用此法在短期内保管。

3.2.1将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，为减缓培养基的水分蒸发，延长收藏时间，可将菌种收藏管的棉花塞换成橡胶塞。

放在4℃左右的冰箱中收藏。

每隔1个月移种一次，继续进行收藏。

3.2.2适用范围：

细菌、酵母菌、真菌收藏。

3.2.3各类菌种收藏条件及时间：

菌种

培养基

保管温度

传种时间

细菌

一般多用营养琼脂或根据菌种规定选用培养基

4~6℃

芽孢杆菌3~6个月

其它细菌每个月

酵母菌

一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂

一般4~6个月

丝状真菌

一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等。

每4个月移植一次

（每2个月移植一次）

3.2.4注意事项：

①收藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。

②收藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；

生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。

③必须定期检查收藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。

④每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续收藏。

⑤铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，应在室温下保管。

3.3液体石蜡保管法：

利用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的收藏期。

3.3.1方法：

3.3.1.1将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5%琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。

3.3.1.2取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

3.3.1.3将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中收藏。

3.3.2适用范围：

适用于收藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌收藏效果较差。

3.3.3注意事项：

①收藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行收藏。

②收藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。

③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。

④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精

灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。

⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使收藏效果欠好；

如太少，斜面容易干燥，将缩短收藏期。

一般以高出斜面1㎝为宜。

⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不克不及太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。

4.菌种在传代、保管或使用过程中发现污染、变异，应及时销毁，不得用于惯例检验。

5.菌种传代、保管及使用、销毁均应填写相应记录：

《0代菌种保管使用记录》、《冻存菌种保管使用记录》、《菌种传代记录》、《菌种使用记录》及《菌种销毁记录》。

6.菌种按“检定菌管理制度”管理。

7.附录：

7.1菌种编号：

传代复苏的菌种应有统一编号,编号方法为:

菌种代号-G或W-代次-管号。

G暗示用于冻存的菌种，W暗示工作用菌种。

□□-□□□□-□-□（□）

注：

①②③④⑤

①菌种代号：

经常使用菌种的代号见下表：

菌种名称

代号

金黄色葡萄球菌

JP

生孢梭菌

SB

大肠埃希菌

DC

铜绿假单孢杆菌

TL

白色念珠菌

BN

短小芽孢杆菌

DX

枯草芽孢杆菌

KC

黑曲霉

HQ

藤黄微球菌

TH

②菌种购进的年、月：

如0608暗示2006年8月购进

③菌种代次，用1、2、3、4、5暗示。

④母代冻存菌种的编号，用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ…暗示。

⑤菌种的序号，用1、2、3…暗示。

7.2经常使用工作用菌种的生物学特征

①金黄色葡萄球菌

形态与染色：

圆球形排列成典型的葡萄状，菌落直径为0.8～1.5mm，革兰氏染色阳性。

培养特性：

⑴在肉汤琼脂培养基、营养肉汤中，生长良好。

在28～38℃生长较好，pH为4.5～9.8，以pH7.4左右最好。

⑵营养琼脂平板，培养24～48小时，形成圆形凸出、边沿整齐、概况光泽且金黄色的菌落，直径1～2mm（应挑选光滑型菌落）。

⑶营养肉汤培养基，生长迅速，经37℃24小时培养呈均匀混浊，管底稍有沉淀，微微振摇即可上升，消散均匀。

但培养基含有可发酵糖类或菌型变成粗糙型者，可出现自然凝集现象，

⑷抵抗力：

在干燥情况下，可生存数月，在无糖培养基内生存数年。

对热80℃30分钟才被杀死。

在1%石炭酸液中15分钟被杀死，碘酒中须1分钟，75%酒精中须数十分钟才被杀死。

②藤黄微球菌

个体略大于葡萄球菌，直径0.5～3.5um，单个成双或四联状排列，或呈不规则的团块。

革兰氏染色呈阳性。

专性需氧菌，营养要求不高，最适温度为25～30℃。

在琼脂平板上培养可形成圆形凸起，光滑、不透明黄色菌落。

在液体培养基中均为混浊生长。

③枯草杆菌

菌体细短棒状，0.7～0.8um宽，2.0～3.0um长，单个或呈链状，两端半圆形，染色均匀。

芽孢0.6～0.9um宽，1.0～1.5um长，椭圆形或圆柱形，常发生于菌体中央或接近中央。

革兰氏染色呈阳性，能运动。

⑴营养琼脂平板：

菌落概况粗糙，圆形，凹凸不服，边沿锯齿状，稍有蔓延，呈白色或微黄色，应挑选粗糙形菌落），本菌变异时可出现光滑型菌落。

⑵营养肉汤培养基中呈少量混浊并生沉淀，在液体概况形成皱状厚膜，粘附于试管壁上。

⑶培养最适温度30～37℃，生长范围15～55℃，兼性厌氧或需氧。

菌体湿热55℃，1小时即被杀死，芽孢能耐高温，100℃3小时才被杀死，120℃40分钟才被杀死。

④短小芽孢杆菌

本菌为杆状，革兰氏染色阳性，无荚膜，芽孢偏生，椭圆形，有动力。

本菌与枯草杆菌相似，培养最适温度30～37℃，生长范围15～50℃，兼性厌氧或需氧。

此外，短小芽孢杆菌有两点分歧于枯草杆菌：

在琼脂培养基上，大多数菌株的菌落为光滑型并变成微黄色，用于检定的菌种，应挑光滑型菌落；

有些菌株营养需要生物素（维生素H）及氨基酸。

⑤大肠埃希菌

短杆菌0.4～0.7um宽，2～4um长，两端钝圆，大多数有5～8根鞭毛，运动活波，但亦有无鞭毛，不运动，不形成芽孢，革兰氏染色阴性。

菌落扁平，光滑，圆润，在EMB琼脂平板上呈紫黑色，有金属光泽。

⑥白色念珠菌

本菌为革兰氏阳性，但染色不均匀，卵圆形，壁薄生芽的酵母样菌。

大小为2.5～4um。

琼脂平板培养，菌落概况湿润粘稠，圆形，乳白色，微凸，边沿整齐。

⑦生孢梭菌

大多数菌株周身皆有鞭毛，能运动，并可形成杆状或梭状芽孢杆菌，菌体一般较粗

大，长约3～8um，宽约0.4～1.2um。

革兰氏染色呈阳性，菌体老化后常可变成阴性。

本菌严格厌氧，培养的最适温度为37℃。

在琼脂平板上培养24～48小时，生长缓慢，菌落直径2～5mm，蔓延生长，边沿不规则，有锯齿状突起；

在硫乙醇酸盐流体培养基中24～48小时生长良好，呈长絮状，伴随恶臭，再培养数日后菌体可自溶，液体由混浊变清。

⑧铜绿假单孢杆菌：

菌体长短纷歧，菌落粘连，培养基被染成绿色。

革兰氏染色呈阴性。

La型菌落：

湿润扁平大山脉状，在营养肉汤培养基中呈易碎菌落，膜下菌液浑浊。

Sm型菌落：

概况粗燥突起，呈乳头状，在营养肉汤培养基中形成厚膜，膜下菌液澄清。

⑨黑曲霉：

菌落为近乎透明的小圆点装或匍匐于培养基概况的不规则丝状物。

镜检为3~10um圆形。

接种至改良马丁培养基上先是形成黄色菌落，后长出孢子。

培养5~7天后可观察到斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不该有杂色；

斜面正面无色，接近菌层培养基略带黄色。