DPPH和ABTSPTIO自由基清除实验疑难解答李熙灿XicanLiWord格式.docx
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DPPH自由基被清除的机制是什么?
DPPH自由基的清除过程主要涉及到氢转移(HAT),简要过程如下:
实验中的溶剂应该怎么确定?
优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品,若样品难溶于水和醇,再考虑DMSO等溶剂。
值得注意的是,实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。
另两个实验(ABTS+•清除和PTIO•清除)同理。
样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗?
不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大,为了保证结果的准确,应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH•清除率均匀分布在0-100%之间,因此1mg/mL只是一个大概数值,实验中要根据预试结果进行调整。
由于1mg/mL这个数字方便稀释和计算,因此在这里统一写作1mg/mL。
测量完成后怎么计算IC50?
IC50值是指清除50%的自由基,所需要的样品的最终浓度。
有两种计算方法。
第一,以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标,清除率为纵坐标,然后计算线性回归方程。
将清除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值,注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值。
第二,通过浓度曲线的图直接读出。
在50%处画一横线,此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标,即IC50.
为什么要用Trolox作为阳性对照?
维生素E(生育酚)是常见的抗氧化剂。
不过,维生素E难溶于水,而且易变质。
为此,化学家将其结构进行修饰,即得Trolox(化学名称:
6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)。
Trolox不仅溶于水,而且易溶于有机溶剂,所以,广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物。
亦称水溶性维生素E。
为了方便对比评价所测物质的抗氧化能力,通常采用Trolox作为DPPH自由基清除实验的阳性对照品。
当然,除了Trolox外,也可以选用其他化合物作为阳性对照,如BHA,儿茶素,谷胱甘肽GSH,维生素C,槲皮素,EGCG等。
为什么会出现清除率为负值的情况?
样品的活性太弱,所以,加入的样品的量较多;
如果这个样本身在519nm处有吸收的话,就会产生一个可观的A值,导致A>
A0,清除率为负。
DPPH•清除率会大于100%吗?
理论上讲,是不可能的。
如果出现这种情况,要检测实验本身有没问题。
ABTS•+清除实验测量抗氧化性的原理是什么?
ABTS二铵盐,中文名:
2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐,它与过二硫酸钾(K2S2O4)反应,可以生成绿色的ABTS•+自由基。
该自由基在734nm有最大吸收,所以,通过检测734nm的吸光度,可以测定其浓度。
一个物质加入到ABTS•+自由基工作液后,如果734nm的吸光度降低,则说明该物质具有自由基清除活性,属于抗氧化剂。
该法称为ABTS自由基清除法,可以用评价植物(或中草药抽提物)、纯化合物的抗氧化能力。
ABTS•+自由基被清除的机制是什么?
由于ABTS•+自由基是一种带正电荷的自由基,因此它可以从抗氧化剂分子中获得一个电子形成稳定的中性分子,故ABTS•+自由基被清除主要涉及到电子转移(ET)机制。
ABTS•+自由基工作液如何配制?
需要用ABTS二铵盐与过二硫酸钾反应12小时才能配制。
DPPH和ABTS自由基清除率有什么不同?
清除率的计算方法大体相同,只不过检测的波长不同,也就是所用的A值不同:
DPPH用A519nm值;
ABTS用A734nm值。
这是因为二者的检测波长本来就不一样。
尽管这样,对于同样的样品、同样的浓度。
DPPH和ABTS自由基清除率,会不同。
这是因为,ABTS自由基比DPPH自由基更容易清除。
换言之,对于同一个样品而言,清除DPPH的IC50值会大于清除ABTS的IC50值。
本文1.8节有对比的实例。
PTIO•清除实验测量抗氧化性的原理是什么?
PTIO溶解后为紫色溶液,当有抗氧化剂清除PTIO时,溶液的颜色会减淡,通过测量吸光度的改变可以测量物质的抗氧化性。
PTIO被清除的机制是什么?
PTIO自由基能够在不同pH的水缓冲溶液中稳定存在,当溶液pH<5.0时,PTIO•清除主要涉及到电子转移(ET),当调节pH值(如pH=5.0,6.0,7.4)时,其清除能力也随之改变,表明与pH值有关,也就是说与氢离子(质子)浓度有关,据此,可证明其涉及PT机制。
PTIO为什么比DPPH自由基难清除?
因为PTIO•比DPPH•自由基稳定。
所以,一般需要2小时才可以清除,当然,活性好的样品,很快也可以发生清除反应,并褪色。
为了较好的实验效果,可以考虑加热或延长反应时间。
第二部分相关知识
DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者,都是常用的自由基。
概述如下表:
DPPH•自由基
ABTS+•自由基
PTIO•自由基
结构式
简单表达式
DPPH·
ABTS·
+
PTIO·
分子式与分子量
C18H12N5O6;
M.W.394.3
C18H24N6O6S;
M.W.548.68
C13H17N2O2;
M.W.233.3
带电情况
中性自由基
阳离子自由基
种类
氮自由基
(成单电子在N原子上)
氧自由基
(成单电子在O原子上)
外观
紫黑色粉末
没有纯的ABTS·
紫褐色粉末
溶解性与溶液颜色
溶于有机溶剂(如甲醇、乙醇)
溶液呈紫色,浓度越高,颜色越深
溶于有机溶剂(如甲醇、乙醇)、水以及水性的缓冲液
溶液呈墨绿色,浓度越高,颜色越深
溶于水以及水性的缓冲液
溶液呈蓝紫色,浓度越高,颜色越深
CAS号
1898-66-4
无
18390-00-6
工作液配制方法
将已购的DPPH自由基粉末,溶解即得其工作液
将已购的ABTS二铵盐[(NH4)2ABTS]与过二硫酸钾(K2S2O8)黑暗中反应12小时后,再稀释得其工作液。
将已购的PTIO自由基粉末,溶解即得其工作液
工作液外观
紫色
墨绿色
蓝紫色
工作液紫外光谱与最大吸收
(50μg/mL)
(0.07mM(NH4)2ABTS+0.03mMK2S2O8)
检测波长
519nm
734nm
557nm(水溶液)
检测原理
当A519nm值减少,表明DPPH·
被清除。
其清除机制主要是氢转移HAT(hydrogenatomtransfer)
当A734nm值减少,表明ABTS·
+被清除。
其清除机制主要是电子转移ET(electrontransfer)
当A557减少,表明PTIO·
其清除机制主要是电子移ET(electrontransfer)加质子转移PT(protontransfer)
用途
主要用于测试一个纯的化合物或者提取物,是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。
通过调节缓冲液的pH值,可以检测其抗氧化机制。
优势
清除速度较快,约30分钟(室温下)。
清除速度较快,约6分钟(室温下)。
(1)水溶性好,与生物相关性强;
(2)是氧自由基,能更好地表往ROS清除水平;
(3)抗氧化机制明确:
pH值小于5.0时,为电子转移ET机制。
当调节pH值(如pH=5.0,6.0,7.4)时,其清除能力也随之改变,表明与pH值有关,也就是说与氢离子(质子)浓度有关,据此,可证明其涉及PT机制。
局限性
(1)只能在有机溶剂(如甲醇、乙醇)中进行,不能在水溶液中进行;
也不能在缓冲液中进行。
(2)其抗氧化活性,实际上是清除氮自由基的活性(而不是氧自由基)。
(3)虽然DPPH的清除主要是HAT抽制,但是在不同溶剂中,其抗氧化机制是不同的,还可能有ET等。
(1)不能在缓冲液中进行。
当然,可以在有机溶剂(如甲醇、乙醇)和水溶液中进行。
(3)配制工作液需要的时间长(约12小时)
(4)ABTS·
+与(NH4)2ABTS、K2S2O8共存于溶液中,无法单独分离。
所以,会导致无法预期的干扰。
清除反应速度较慢,约2小时完成。
不过,如果出现这种情况,可以适当加热(如37℃、50℃),或延长反应时间。
所需仪器
可见分光光度计(常量,检测液约3mL)
酶标仪(微量,检测液约200μL)
第三部分DPPH•自由基清除实验指导[1]
3.1DPPH测试液的配置
取DPPH固体1mg溶于24mL95乙醇(或无水乙醇、甲醇)中,超声5min,充分振摇,务使上下各部分均匀。
最好避光保存,5小时内用完。
取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液,加0.5mL95乙醇(或无水乙醇、甲醇)稀释后,使其吸光度为0.6-1.0之间。
若吸光度过大,则继续加溶剂;
若吸光度过小,则补加DPPH固体或者原始溶液。
3.2样品液的配置
样品用合适的溶剂溶解,为便于计算,可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择,首选甲醇、95乙醇或无水乙醇(尽量与DPPH溶液所用溶剂相同),如不溶可用DMSO。
3.3预试
取DPPH溶液1.0mL,加0.5mL相应有机溶剂后,往其中加少量样品液。
加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜色基本褪去时,记下样品的加样量。
如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。
此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的基础上,往前设置5个用量,使之成等差数列。
【如】在预试过程中,发现加样到500μL时,DPPH溶液颜色基本褪去,则500μL为该样品液的最大用量。
则对于该样品而言,其用量梯度宜设为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL。
A0值:
取DPPH溶液1.0mL到比色皿中,加对应有机溶剂0.5mL,稀释混合,测A值,此A值为A0(A0须在0.8-1.0之间)。
A值:
取(500-x)μL有机溶剂到比色皿中,加样品液xμL(x是根据1.3预试结果确定样品液的用量),再加DPPH溶液1.0mL,混合使反应液总体积为1.5mL。
测A值。
【如】某样品的用量梯度为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL,则加样如下:
样品液
95乙醇(或无水乙醇)
DPPH测试液
总体积
0μL
100μL
500μL
400μL
1.0mL
1.5mL
200μL
300μL
300μL
200μL
400μL
100μL
500μL
0μL
3.4最终测量:
每测一个用量需要测三个平行数据。
3.5DPPH•清除率(抑制率)的计算
(A0为不加样品时的值;
A为加入样品后的值。
)
3.6使用注意事项
3.6.1测量前,要先用空白溶剂调零。
3.6.2将溶液注入比色皿后应当充分摇匀,使颜色均匀分布。
3.6.3每次使用前后要注意比色皿的清洁。
3.6.4如果在实验过程中出现A值大于A0的情况,则可能是由于样品本身产生的本底吸收所致,此时,应该减去本底吸收的A值(A本)。
这个A本值可以通过,加样品但不加DPPH的方法测得。
此时的计算公式为:
3.7实例
漆黄素清除DPPH•自由基量效曲线图:
说明:
绘图软件为MicrocalOrigin,导出格式为TIFF。
BHA,Trolox二者均为阳性对照组;
漆黄素的结构式如下:
第四部分ABTS·
+自由基清除实验指导[2]
4.1溶液配制
4.1.1ABTS二铵盐储备液(7.4mmol/L):
取ABTS二铵盐3mg,加蒸馏水0.735mL。
(MW=548.7)
4.1.2二硫酸钾(K2S2O8)储备液(2.6mmol/L):
取K2S2O81mg,加蒸馏水1.43mL。
(MW=270.32)
4.1.3取0.2mLABTS二铵盐储备液和0.2mLK2S2O8储备液混合,黑暗环境下室温放置12小时,用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸光度为0.70±
0.02,此溶液即为ABTS•+自由基工作液。
(注:
也可以用95乙醇或无水乙醇,但必须是原装分析纯试剂,回收或重蒸者均不可用。
4.2样品液的配置样品用合适的溶剂溶解,为便于计算,可配成1mg/mL浓度。
溶剂根据样品的极性进行选择,首选95乙醇或无水乙醇,如不溶可用DMSO。
4.3预试取ABTS•+自由基工作液0.8mL,往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,当溶液颜色基本褪去时,记下样品的加样量。
如果反应缓慢,可在37℃烘箱中放置半个小时。
【如】在预试过程中,发现加样到100μL时,ABTS•+自由基工作液颜色基本褪去,则100μL为该样品液的最大用量。
则对于该样品而言,其用量梯度宜设为20μL、40μL、60μL、80μL、100μL。
取ABTS•+自由基工作液800μL加入到比色皿中,加95乙醇(或无水乙醇)200μL,稀释混合,测A值,此A值为A0(A0宜在0.70±
0.02)。
取(200-x)μL95乙醇(或无水乙醇)加入到96孔板中,加样品液xμL(x是根据2.3预试结果确定样品液的用量),再加ABTS•+自由基溶液800μL,混合使反应液总体积为1mL,测A值。
【如】某样品的用量梯度为20μL、44μL、60μL、80μL、100μL,则加样如下:
ABTS•+自由基溶液
20μL
180μL
800μL
1000μL
40μL
160μL
60μL
140μL
80μL
120μL
4.4最终测量
参照4.3节,每个浓度平行测三次。
4.5ABTS•+清除率(抑制率)的计算
(A0为不加样品时的值;
4.6实例
漆黄素清除ABTS•+量效曲线图:
(见1.8节)
第五部分PTIO•自由基清除实验指导[3]
3.1PTIO•测试液的配置
3.1.1取PTIO固体3mg溶于20mL蒸馏水中,超声5min,充分振摇,务使上下各部分均匀,得“PTIO测试液”。
(PTIOM.W.233.3)
3.1.2用空白溶剂调零后,取800μL“PTIO测试液”和200μL缓冲液或甲醇(与PTIO溶液中的溶剂保持一致)于比色皿中,在557nm处测A值,即得A0值。
A0在0.2-0.6之间。
样品用缓冲液或甲醇、乙醇溶解,配成1mg/ml浓度的溶液,可适当超声使之完全溶解。
如果溶解性差,浓度小于1mg/ml也可以。
3.3.1取“PTIO测试液”800μL,往其中加少量样品液,加样时,先少后多渐加,边加边混合,并观察溶液的褪色情况,不能立即褪色时则37℃水浴2小时后再观察,当溶液颜色基本褪去时,记下样品的加样量。
3.3.2此加样量即为样品的最大用量,在此最大用量的基础上,往前设置5个用量,使之成等差数列。
(如,在预试过程中,发现加样到200μL时,PTIO溶液颜色基本褪去,则200μL为该样品液的最大用量。
则对于该样品而言,其用量梯度宜设为0μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL)。
3.4A值测量
用移液枪取“PTIO测试液”800μL加入到比色皿中,加样品液xμL(x是根据3.3预试结果确定样品液的用量),再加(200-x)μL甲醇混合,37℃水浴(或烘箱)30分钟或更久后,测A557nm值。
【如】某样品的用量梯度为0μL(测出的A即A0值)、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL,其加样表如下:
甲醇(或水)
PTIO测试液
1000μL
3.5最终测量
参考3.4的操作,每测一个用量需要测3个平行数据。
3.6PTIO•清除率(抑制率)的计算
A为加入样品后的值)。
E-白藜芦醇(E-resveratrol)和Z--白藜芦醇(Z-resveratrol)清除PTIO•自由基的浓度曲线图(Trolox为阳性对照组).
参考文献
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[2]Li,X.;
EvidencefromAcacetinandIsoginkgetin.2019,Molecules.24,2039.
[3]Li,X.C.,2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide(PTIO•)RadicalScavenging:
ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro.J.Agric.FoodChem.,2017.65,6288-6297
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