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目录
摘要1
一、引言1
1.1β-乳球蛋白的结构与应用1
1.2β-乳球蛋白的致敏性及其水解改性2
二、实验材料与方法4
2.1实验材料4
2.2试剂与仪器设备4
2.2.1试剂4
2.2.2主要仪器设备4
2.3实验方法4
2.3.1测定指标与方法4
2.4试验方案的设计6
2.4.1温度对β-乳球蛋白水解影响的检测方法6
2.4.2时间对β-乳球蛋白水解影响的检测方法6
2.4.3酶添加量对β-乳球蛋白水解影响的检测方法6
2.4.4正交实验7
2.4.5电泳实验7
三、结果与分析9
3.1温度对氨基酸态氮含量的影响结果9
3.2时间对氨基酸态氮含量的影响结果10
3.3酶添加量对氨基酸态氮含量的影响结果10
3.4正交实验结果11
3.5电泳检测结果13
四、讨论14
五、结论15
致谢17
参考文献18
Abstract20
β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究
作者:
李晋津指导老师:
薛秀恒
(安徽农业大学茶与食品科技学院合肥230036)
摘要:
本实验以β-乳球蛋白为原料,通过单因素与正交实验,以甲醛滴定法测定蛋白水解后氨基酸态氮含量,确定中性蛋白酶水解β-乳球蛋白的最佳温度、时间、酶添加量,以实现β-乳球蛋白的改性及降解β-乳球蛋白。
结果表明,中性蛋白酶水解β-乳球蛋白的最佳条件为50℃水浴温度下,0.0079g中性蛋白酶水解40分钟;
SDS-PAGE蛋白电泳显示,β-乳球蛋白被酶解为小肽。
关键词:
中性蛋白酶;
β-乳球蛋白;
酶解;
小肽
一、引言
1.1β-乳球蛋白的结构与应用
β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)是由乳腺上皮细胞合成的特有蛋白,普遍存在于驯鹿、猪、马、羊、猫和狗等多种哺乳动物的乳汁中,但是在单峰驼和人乳中不存在或含量甚微[1]。
牛奶中的β-Lg分子质量在18kD左右,等电点为5.3,共由162个氨基酸残基组成,含有5个半胱氨酸残基。
β-Lg由非共价键连接的2个单位亚基组成,每个单体含有2个二硫键(Cys66-Cys160和Cys106-Cysl19)和一个自由巯基(Cysl21)。
β-Lg在牛奶中主要以二聚体的形式存在,二聚体像一个拉长的椭圆体,长约6.95nm,宽约3.6nm[2]。
β-Lg具有紧密的三级结构,单体近似球形,它的三维结构在pH中性时,由8条反平行链组成β-桶状结构,有1个α+1拓扑,此结构外部有1个含有3个转角的a-螺旋和9条β链(A、B、C、D、E、F、G、H、I)[1]。
A-D链形成一个面,E-H链形成另外一个面。
A链与其它3条链(B、H、I)氢键结合,A链和H链之间的结合形成β-桶状结构的闭合,外面有a-螺旋保护β-桶状结构[3]。
EF链形成的结构作为结合位点的“大门”,当pH较低时,“大门”关闭,结合位点受抑制;
当pH较高时,“大门”开放,配体可以与结合位点结合。
如图1-1。
图1-1β-乳球蛋白的三维结构示意图
研究表明,β-乳球蛋白中心形成一个疏水性结构,β-乳球蛋白具有很强的结合脂溶性维生素及脂肪酸的能力,可以作为像VA、VE等脂溶性营养物质的添加载体,这可用于生产无脂或低脂且富含脂溶性维生素的营养食品。
目前,β-乳球蛋白的应用主要是在食品工业上,由于其具有多种生物学活性,同时经蛋白酶水解后仍可得到多种生物活性肽,因此被应用于食品加工中。
β-Lg的热变性与牛奶加工密切相关,可以利用在不同加热条件下,β-Lg含量的变化规律区分不同加工类型的牛奶。
国际乳业联合会(IDF)规定巴氏杀菌乳和高温巴氏杀菌乳中可溶性β-Lg的质量浓度应分别大于2600mg/L和2000mg/L,UHT乳中可溶性β-Lg浓度应高于50mg/L[4]。
因此,β-Lg可以作为牛奶热加工程度的评价指标。
在生奶样中添加β-乳球蛋白,不仅可以增加乳清蛋白的浓度,而且还能推迟UHT乳(瞬时超高温灭菌乳)的凝集时间。
β-Lg具有很强的脂肪酸结合力,一般作为功能性配料使用。
由于β-乳球蛋白对脂溶性维生素(如VA,VE等)有一定的吸附作用,可作为维生素的载体应用在食品加工中。
目前,一些生产商已采用热诱导β-乳球蛋白胶来模仿和替代脱脂食品中的动物脂肪[5],从而作为脂肪的替代品应用在低脂食品的加工生产中。
此外,β-Lg固有的生物活性,如抗氧化性,可以应用于化妆品生产。
1.2β-乳球蛋白的致敏性及其水解改性
随着对β-乳球蛋白的深入研究,发现它是婴儿牛乳过敏症的主要致敏原。
据报道有0.5%~7.5%的婴儿会发生对牛乳的过敏反应,如湿疹、腹泻等[6]。
这是由于新生儿的胃肠道通透性较强,可直接吸收β-乳球蛋白,从而引起婴儿的过敏反应[7]。
因此消除牛奶中主要致敏原β-乳球蛋白的致敏性仍是国际乳制品加工技术研究的热点之一。
消除β-乳球蛋白致敏性的主要措施是将β-乳球蛋白过敏原进行降解。
目前,对β-乳球蛋白过敏原进行降解的方法有加热、加压、酶解、化学改性与发酵改性等,但对目的蛋白的直接酶解方法以其安全性高、工艺操作简便且便于控制等优点成为大多数研究者是首选的方法[8-10]。
蛋白酶是以蛋白质一级序列结构中的某一肽键为切割位点的,具有专一性与靶向性,每一种蛋白酶在蛋白表面都以不同的肽键作为靶点,如果靶点存在于β-Lg过敏原表位上,在蛋白酶对蛋白质进行水解的过程中,可以靶向地切割过敏原表位的肽键,产生氨基酸,消除致敏性[11]。
Linda利用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用水解β-乳球蛋白,发现水解后的β-乳球蛋白的过敏性降低,但不会完全消除[12]。
Bernard用胰蛋白酶水解酪蛋白,发现其可以水解肽链第1~52位,53~139位片段,用纤溶酶可以水解酪蛋白的第106~209位片段这些多肽片段中包含有过敏性表位,经水解后可以使酪蛋白的过敏性降低[13]。
也有研究者对几种酶的β-Lg酶解性能进行了筛选,结果表明菠萝蛋白酶与中性蛋白酶降低了β-Lg大部分的致敏性,胰凝乳蛋白酶对致敏性的消除效果较好[14-15]。
前期的研究,大多数是以碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等进行酶解,胃蛋白酶是外肽酶,优先选择苯丙氨酸或酪氨酸残基的C末端降解,特异性水解疏水链端N。
外肽酶不能水解分子内肽键,分子内大量的肽键得以保存,从而不能有效提高水解度。
中性蛋白酶是内肽酶,催化蛋白水解时基团专一性较差,主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺键,水解蛋白质分子内部的肽键,生成相对分子量较小的多肽。
但目前对中性蛋白酶的酶解作用研究甚少,其最佳酶解条件不甚明确,因此,本实验以牛乳中主要致敏原β-乳球蛋白为研究对象,通过中性蛋白酶水解作用的因素研究,确定中性蛋白酶水解β-乳球蛋白的最佳酶解条件,增强中性蛋白酶在β-乳球蛋白过敏原表位上的识别靶向性,提高中性蛋白酶对β-乳球蛋白的脱敏效果,降低β-乳球蛋白的致敏性,这对提升乳制品的食用价值具有重要意义,为β-Lg在乳品工业中的应用提供理论和实验依据。
二、实验材料与方法
2.1实验材料
β-乳球蛋白标准品sigma公司生产
中性蛋白酶(6000活力单位/克)北京索莱宝科技有限公司
2.2试剂与仪器设备
2.2.1试剂
NaOH分析纯
邻苯二甲酸氢钾分析纯
95%乙醇分析纯
酚酞分析纯
甲醛溶液分析纯
丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺Beijingsolarbioscience&
technology公司生产
尿素(电泳级)biosharp公司生产
TrisBase和SDSAmresco公司生产
2.2.2主要仪器设备
核酸蛋白检测仪BibbyScientificLtd
PHS-3D型酸度计金坛市盛蓝仪器制造有限公司
SL202N型电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司
EL204型分析天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
数显恒温水浴锅江苏金坛市金城国胜实验仪器厂
DYY-6C型电泳仪北京六一仪器厂
2.3实验方法
2.3.1测定指标与方法
实验以游离氮含量为指标,用甲醛滴定法测定中性蛋白酶水解β-乳球蛋白后的氨基酸态氮含量,以分析水解效果。
具体方法为:
吸取酶解液20mL加入烧杯中,加60mL纯水搅匀。
酸度计测pH,以0.05mol/LNaOH滴定至酸度计指示计为8.2,记下消耗的NaOH溶液的体积。
然后向其中加入10.0mL甲醛溶液,滴定至溶液pH为9.2,记下消耗的NaOH体积。
同时以80mL纯水做空白实验。
记下消耗的NaOH体积V2。
氨基酸态氮含量%=
(公式2-1)
式中:
V1—实验组在甲醛滴定终点(pH9.2)所消耗的NaOH标准溶液的体积;
V2—空白组在甲醛滴定终点(pH9.2)所消耗的NaOH标准溶液的体积;
c—NaOH标准溶液的浓度,mol/L;
m—测定用样品溶液相当于样品的质量,g;
0.014—
N2的毫摩尔质量,g/mmoL。
实验所需溶液配制:
(1)β-乳球蛋白溶液的配制:
称取50mg的β-乳球蛋白标准样品,加纯水溶解后,定容至50mL容量瓶中,摇匀,制成1mg/mL的稀释液置4℃冰箱中备用。
(2)0.05mol/LNaOH溶液配制:
准确称取1.0gNaOH,用去CO2蒸馏水定容至500mL容量瓶中。
盖紧胶塞,摇匀,置于广口瓶中备用。
(3)0.05mol/LNaOH溶液的标定:
称取0.36g邻苯二甲酸氢钾(105℃下烘干)于三角瓶中,倒入50mL去CO2水混匀。
向其中加入2滴酚酞试剂。
用上述所配的0.05mol/LNaOH溶液滴定至瓶内液体为粉红色,30s不褪色。
记下消耗的NaOH溶液的体积V1。
平行四组,结果如表2-1。
做空白实验,记下消耗NaOH溶液体积V2。
计算公式:
c(NaOH)=m×
100/(V1-V2)×
MM=204.22(公式2-2)
表2-1邻苯二甲酸氢钾质量m与消耗的NaOH体积V1
称取邻苯二甲酸氢钾的质量m(g)
实验组消耗NaOH体积V1(mL)
0.3600
35.50
0.3603
35.40
0.3606
35.43
0.3608
35.45
空白组消耗NaOH体积V2=0.020mL
将表2-1数据带入公式求得c(NaOH),取平均值,c(NaOH)=0.04982mol/L,说明上面所配0.05mol/LNaOH溶液符合要求。
2.4试验方案的设计
首先,选定酶解反应的单因素条件,即温度、时间、酶添加量,根据查阅资料在中性蛋白酶最适反应温度上下选定5个水平条件,如表2-2。
表2-2酶解条件单因素实验水平因素
序号
温度(℃)
时间(min)
酶添加量(g)
1
30
0.002
2
40
60
0.004
3
45
90
0.006
4
50
120
0.008
5
55
150
0.010
2.4.1温度对β-乳球蛋白水解影响的检测方法
分别称取0.006g中性蛋白酶加入2mL配制的β-乳球蛋白样液于5个试管中,标号1、2、3、4、5,调节水浴温度30℃、40℃、45℃、50℃、55℃,水浴30min,然后沸水浴10min。
冷却后将其定容至100mL,摇匀静置。
吸取20mL于烧杯中,加入60mL纯水搅匀。
后按2.3.1.1甲醛滴定法操作,记下pH9.2时消耗的NaOH的体积V1。
2.4.2时间对β-乳球蛋白水解影响的检测方法
分别称取0.006g中性蛋白酶加入2mL配制的β-乳球蛋白样液于5个试管中,分别标号1、2、3、4、5,调节水浴温度为45℃,分别水浴30min、60min、90min、120min、150min,然后沸水浴10min。
吸取20mL于烧杯中,加入60mL纯水。
2.4.3酶添加量对β-乳球蛋白水解影响的检测方法
分别称取0.002g、0.004g、0.006g、0.008g、0.010g中性蛋白酶,加入2mL配制的β-乳球蛋白样液于5个试管中,分别标号1、2、3、4、5,45℃条件下水浴30min,然后沸水浴10min。
后按2.3.1.1甲醛滴定法操作,记下pH9.2时消耗的NaOH的体积V1。
2.4.4正交实验
在上述单因素水平实验基础上,取水解温度、时间、酶添加量为考察因素,各取三个水平,用L9(33)正交表进行实验,以氨基酸游离态氮为指标,选出最佳方案。
因素水平见表2-3。
表2-3酶解条件正交实验因素水平
温度(℃)时间(min)酶添加量(g)
40200.004
45300.006
50400.008
2.4.5电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是分离蛋白质的常用生化方法,样品的蛋白质分子热变性解聚后与SDS结合形成带负电的蛋白质-SDS复合物,复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小,使用均匀浓度的SDS-PAGE来分析分子量在15~200kDa的蛋白质时,电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。
本实验采用Tricine-SDS-PAGE方法进行电泳实验。
首先配制储存液及缓冲液:
(1)3C丙烯酰胺储存液:
将48g丙烯酰胺和1.5g甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100mL。
(2)5C丙烯酰胺储存液:
用重蒸水溶解47g丙烯酰胺和2.5g甲叉双丙烯酰胺成100mL溶液。
(3)6C丙烯酰胺储存液:
用重蒸水溶解46.5g丙烯酰胺和3.0g甲又双丙烯酰胺成100mL溶液。
(4)正极缓冲液(10×
):
121.14gTris溶于400ml重蒸水,用1.0mol/LHC1调至pH8.9,定容至500ml。
(5)负极缓冲液(10×
将60.55gTris,89.58gTficine及5gSDS溶于400ml重蒸水中,加水至终体积为500ml。
(6)凝胶缓冲液的配制:
将181.5gTris,1.5gSDS溶于400ml重蒸水中,用1mol/LHCl滴定至pH8.45,再加水稀释至500mL。
尿素(U)能增强分离效果,致密胶可配成6C+U、5C+U、5C,但经研究5C+U制成的聚丙烯酰胺凝胶对特小分子量的蛋白标准品分离效果最好[16],故本实验采用5C+U的丙烯酰胺溶液制胶。
见表2-4。
表2-45C+U丙烯酰胺溶液配制
组分
浓缩胶
夹层胶
致密胶(5C+U)
凝胶缓冲液(3X)
0.6mL
0.5mL
1mL
3C凝胶储存液
0.125mL
/
5C凝胶储存液
尿素
1.08g
加水至
1.8mL
1.5mL
3mL
操作步骤如下:
(1)灌胶:
凝胶制作采用三层不连续胶的结构,由致密胶、夹层胶、浓缩胶构成。
每层胶分别加入10μL的过硫酸铵和2μL的TEMED加速凝胶凝固,然后灌胶,先灌下层的致密胶,再覆以中间的夹层胶,然后铺浓缩胶。
静置以形成不连续的梯度凝胶。
(2)点样:
取10μL的蛋白质标准品,煮沸5min使蛋白质与SDS结合变性,小心点入凝胶的点样孔中。
(3)电泳:
内槽加入负极电泳缓冲液,外槽加入正极电泳缓冲液,形成Trcine-SDS-PAGE电泳系统,以恒定电压电泳2h(浓缩胶、夹层胶恒定电压30V,致密胶恒定电压100V)。
(4)考马斯亮蓝染色:
戴上手套将胶移入一个盛有约20mL考马斯亮蓝染液的容器内,在摇床上缓慢震荡10-20min。
(5)脱色:
弃去染液,将凝胶在水中漂洗数次。
加入约50mL的考马斯亮蓝脱色液,脱色1h。
为了脱色完全,需数次更换脱色液并震荡过夜。
3、结果与分析
3.1温度对氨基酸态氮含量的影响结果
图3-1温度对氨基酸态氮含量的影响
由图3-1可知在研究温度因素时,在30℃~45℃范围内,氨基酸态氮含量随温度的升高而增加,在45℃时水解效果最佳,氨基酸态氮含量达到了31.5%。
之后随着温度上升,氨基酸态氮含量反而下降。
由此我们可以得出,中性蛋白酶只有在一定的温度范围内才能保持对乳清蛋白较高的水解活性,温度过高过低都会对其水解能力产生重要影响,故我们选择45℃为最佳酶解温度。
出现这种现象的原因可能是当开始温度较低时,酶的活性及水解效果随温度的升高而增加,β-乳球蛋白的水解效果也不断增大。
当温度持续升高到超过酶的耐受温度一定值时,水解的增大已不能补偿酶失活对水解造成的负影响,此时乳清蛋白的水解度下降[17-18]。
因此研究单因素温度时,我们选择45℃为最佳酶解温度。
3.2时间对氨基酸态氮含量的影响结果
图3-2反应时间对氨基酸态氮含量的影响
由图3-2可以看出酶解时间30分钟时,水解后氨基酸态氮含量最高,达到了31.5%,之后随着反应时间的延长,水解后的氨基酸态氮含量逐渐下降且趋于平稳,氨基酸态氮含量变化不大。
分析原因可能是由于酶解时间延长,使得酶活性降低或失活。
故实验结果显示水解30分钟酶解效果最好。
而有研究以木瓜蛋白酶组合、中性蛋白酶组合进行β-乳球蛋白的酶解试验,结果显示在120min之内,水解效果变化不大。
因此,本试验选择最短的30分钟作为β-乳球蛋白的降解时间[19]。
3.3酶添加量对氨基酸态氮含量的影响结果
图3-3酶添加量对氨基酸态氮含量的影响
由图3-3可看出,在酶添加量0.002~0.006时,随着酶量的增加,水解后氨基酸态氮含量不断增加,水解效果增强。
当中性蛋白酶添加0.006g时酶解效果最好,氨基酸态氮含量达到了37.62%。
此后,继续增加酶量,氨基酸态氮含量下降,酶解效果变差。
说明在酶添加量大于0.006g时,β-乳球蛋白始终处于过饱和,水解过程中,酶浓度的增大并未明显增大水解反应速度,继续增加酶量,游离氨基酸态氮含量变化不大,逐渐趋于平稳。
3.4正交实验结果
表3-1酶解条件的正交实验结果
实验号
氨基酸态氮含量%
20
35.00
14.00
31.85
34.13
28.88
6
39.38
7
41.65
8
27.13
9
46.38
运用SAS系统分析表3-1数据,得到酶解条件最优组合10个如下表3-2:
表3-2SAS系统统计结果
X1
X2
X3
Y
0.0079
0.530636913
49.8
0.5279286862
49.6
0.5251532058
49.4
0.5223104718
49.2
0.5194004842
39.6
0.516540913
49
0.516423243
0.0076
0.515121612
0.5139142862
10
0.5133787482
注:
X1、X2、X3分别代表温度、时间、酶添加量,Y代表氨基酸态氮含量
运行SAS系统分析如图3-4-1、3-4-2:
Y:
游离氮X1:
温度X2:
时间
图3-4-1温度与时间的交互作用影响
由图3-4-1可看出,时间为主导因素。
就温度这一因素看来,氨基酸态氮含量随着温度的升高而增大,在50℃时达到最高。
就时间因素来看,氨基酸态氮含量最低点大概在30分钟左右,当反应时间小于30分钟时,氨基酸态氮含量随时间的延长而降低。
当反应时间大于30分钟时,氨基酸态氮含量随反应时间的延长而增大,在40分钟时含量达到最大。
温度X3:
酶添加量
图3-4-2SAS系统运行结果图
由图3-4-2可以看出在分析温度与酶添加量交互作用时,温度起主导作用,氨基酸态氮含量随温度变化趋势较大,且随着温度的升高而增加,在50℃时含量最高,达到50%以上。
就酶添加量而言,氨基酸态氮含量随酶添加量增减变化不大,相对较低点在酶添加量0.006g左右,添加0.0079g酶时氨基酸态氮含量最大,故最佳酶添加量为0.0079g。
以上两个图分析得知在温度与时间的交互作用中,总体上氨基酸态氮含量随温度升高而增大,50℃时含量最大,相较而言时间起主导作用,反应时间小于30分钟时氨基酸态氮含量随时间延长而降低,大于30分钟时情况则相反,故选择氨基酸态氮含量达最高值:
即反应时间40分钟为最佳酶解时间。
温度与酶添加量相互作用分析时,温度为主导作用,氨基酸态氮含量随温度升高而增大,50℃时最大。
氨基酸态氮含量随酶添加量增减变化不大,添加0.0079g酶时氨基酸态氮含量最大高。
而时间与酶添加量之间无相互作用,说明这两个条件的交互作用对酶解反应无影响。
故通过SAS系统分析,得出中性蛋白酶水解β-乳球蛋白的最佳酶解条件为50℃条件下,0.0079g中性蛋白酶水解40min。
3.5电泳检测结果
图3-5中性蛋白酶酶解β-乳球蛋白电泳图
Marker:
超低分子量蛋白L:
中性蛋白酶解产物
本
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