第四章大分子的分离和分析精Word格式文档下载.docx
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在这种情况下,细胞会很快破裂,使混浊的细胞悬液变成完全澄清的粘稠液体。
此时,由于在pH12.0-12.5这样狭小的范围内,线性染色体DNA发生变性,而质粒DNA(cccDNA)不会变性。
溶液Ⅲ:
1.5倍溶液Ⅰ体积。
该溶液为高浓度的醋酸钾缓冲液(3M,pH4.6)。
在中和过程中,高分子量的染色体DNA复性并聚积成不溶的沉淀,同时高浓度的盐引起蛋白质与SDS复合物以及大分子的RNA形成沉淀。
而质粒DNA是环状的,在变性之后经过中和仍保持环状,处于可溶解状态。
经高速离心,上清液即为质粒DNA粗制品。
2.通过试剂盒分离纯化E.coli质粒DNA
操作过程如图4-1。
二、DNA的电泳检测
1.琼脂糖凝胶电泳
检测DNA是否真的存在,是否有降解现象,DNA经限制性内切酶酶切后其产物的大小。
目前最成熟的检测DNA的技术是琼脂糖凝胶电泳。
琼脂糖从海藻中提取的一种线状高聚物,在0.7%的琼脂糖浓度下,对0.8~10kb的DNA有最佳的分离效果。
上样缓冲液:
含有40%的蔗糖,用于将DNA样品沉积在点样孔内,使样品不易扩散;
还含有溴酚兰等指示剂,用于观察电泳的进程。
电压:
DNA样品都是约pH8.0进行保藏或分析的,在这一pH条件下,DNA是带负电的。
因此DNA的泳动方向是从负极走向正极。
一般电场的大小为5伏/厘米左右。
DNA构象:
质粒DNA有三种构象,即闭合环状超螺旋(ccc型)、缺口环状(nick)和线状,它们的泳动速率依次递减。
染色:
溴化乙啶可很好地掺入到双链DNA中,在紫外光的激发下会发出橙红色的荧光,可用于对DNA进行染色和观察。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
聚丙烯酰胺凝胶电泳可很好的分离100bp-1kb大小的核酸分子,对单链核酸来说,其分辨率可达1bp。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺经过聚合而成的高分子聚合物,其聚合度由浓度和二者的比例决定。
一般在变性条件下使用,主要用来检测小分子核酸的大小,或在同位素标记的情况下分析单链核酸,如分离寡核苷酸探针、S1核酸酶产物分析和DNA测序等。
三、DNA片段的纯化(从agaroe)
1.低熔点琼脂糖凝胶电泳法
低熔点琼脂糖在水溶液中的溶解温度(meltingpoint)很低,在65℃以下;
当温度降低到20-30℃时凝结成固形物。
如果需要分离特定的DNA片段,可用低熔点琼脂糖凝胶进行分析,然后切割带有目标DNA的琼脂糖凝胶块,加入适量缓冲液,加热到60℃,凝胶溶化,DNA进入水溶液中,最后通过苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的DNA片段。
2.透析袋电洗脱法
将含有目标DNA片段的琼脂糖凝胶块切割下来,放在透析袋中,置于电泳缓冲液中电泳,DNA将从凝胶块中“跑”出来。
常用于回收5kb以上的DNA片段。
3.GlassMilk(bead)结合法
琼脂糖凝胶在3倍体积的3MNaI溶液作用下于55℃会溶化,从而将DNA释放到水溶液中;
在这样的高盐浓度下,有一种硅珠(glassbead,硅的细微颗粒,其水溶液呈牛奶状,故亦称玻璃奶,glassmilk)可特异性吸附DNA。
当硅珠吸附DNA后,通过离心的方法很容易对硅珠进行洗涤,然后用水或低盐缓冲液可从硅粒中将吸附的DNA洗脱出来。
4.Qiagen纯化柱
第一节RNA的分离、检测和纯化
在细胞中除了DNA外还有RNA,即rRNA、tRNA和mRNA。
对于基因操作来说,涉及到的RNA主要是 mRNA,而mRNA在细胞中的含量又是最少的。
一个典型哺乳动物细胞约含10-5mg RNA ,其中80-85%为rRNA(28S,18S和5S三种rRNA),其余15~20%主要由各种类型的低分子量RNA组成(如tRNA,核内小分子RNA等)。
mRNA为总RNA的1~5%。
同时由于mRNA是单链的,容易受到核酸酶的攻击,导致在RNA的操作过程中易于遭遇降解的厄运。
因此,对RNA的操作要求比DNA的操作更严格,操作时必须设置专门的处理方法和程序。
一、注意事项------控制潜在的RNA酶的活性
1.用具和溶液的去RNA酶处理
用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水浸泡后再灭菌,或购买无RNA酶污染的用具。
对于电泳用具最好使用专用的,不要用于其它分析,在使用之前用洗涤剂洗涮干净,再用3%H2O2和0.1%DEPC处理的水浸泡,清洗干净。
2.RNA酶抑制剂的使用
为了进一步防范RNA降解,一般在RNA样品和RNA反应中加入RNA酶抑制剂,现在应用较多的是蛋白类抑制剂,如人胎盘RNase抑制剂。
除此之外,还有氧铜核糖核苷复合物(完全抑制剂,且抑制体外翻译)和硅藻土(吸附RNase吸附剂)。
二、RNA的抽提和纯化
1.酚-异硫氢酸胍抽提法
TRIZOL试剂是使用最广泛的抽提总RNA的专用试剂,由Gibco公司根据酚-异硫氢酸胍抽提法设计,主要由苯酚和异硫氢酸胍组成。
对任何生物材料的RNA提取,首先研磨组织或细胞,或使之裂解;
加入该试剂后,可保持RNA的完整,同时进一步破碎细胞并溶解细胞成分;
加入氯仿抽提,离心,水相和有机相分离;
收集含RNA的水相;
通过异丙醇沉淀,可获得RNA样品。
2.硅胶膜纯化法
RNeasy试剂盒是由Qiagen公司设计,其设计思路与DNA的分离纯化思路相似(见图8.1),也就是含有目标核酸的细胞破碎液通过硅胶膜时,核酸吸附在硅胶膜上,从而与其它细胞成分分开,然后在低盐浓度下核酸可从硅胶膜上洗脱出来。
三、mRNA的纯化
mRNA的纯化主要是针对真核生物而言的,由于真核生物mRNA的3'
端有一个poly(A)尾,可用亲和层析的方法纯化。
有许多类型的商业化层析柱可用于mRNA的纯化。
四、RNA的电泳检测
RNA的浓度和纯度可通过测试其OD260来判断,OD260为1时相当于浓度为40mg/ml。
而要直观地观察RNA的存在以至于分析,可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来完成。
通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA分析和DNA分析的原理是类似的。
不同的是,RNA分析是在变性的条件下进行的。
常用的变性剂为甲醛,也可使用氢氧化甲基汞和乙二醛-二甲基亚砜(DMSO)。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小分子量的单链核酸,如小分子量RNA寡核苷酸、DNA序列分析等。
其变性条件可用加热方式,或使用尿素等变性剂。
第三节蛋白质的SDS-PAGE
一、检测蛋白质的分子量(见实验)
二、Westernblot(见本章第四节)
三、蛋白质氨基端序列测定
3.1电泳
3.2转膜PVDF
3.3染色、脱色
3.4干燥、检测
第四节分子杂交
分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法,用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在,以及其分子量大小。
根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交,以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。
一、Southernblotting
1.转膜
当目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后,在0.4NNaOH碱性条件下变性,再在1.5MNaCl/1MTris(pH7.4)条件下中和使DNA仍保持单链状态。
然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式,将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。
最后通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
图4-2是通过毛细管渗吸法进行Southernblotting的经典装置图。
2.分子杂交
2.1
预杂交
将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交,也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来,防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。
2.2杂交
在一定的溶液条件和温度下,将标记的核酸探针与滤膜混合,如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列,那么探针将与该分子形成杂合双链,从而吸附在滤膜上。
2.3洗膜
经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。
3.检测
3.1放射性标记、检测
在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素,如32P,33P和35S。
在掺入核苷酸的标记过程中,只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中,因此使用α位磷酸被标记的三磷酸核苷酸,如[α-32P]dATP。
而在标记5'
末端磷酸基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的ATP。
放射性的信号通过X-光片放射自显影或磷屏扫描获取。
3.2非放射性标记、检测。
其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛(digoxygenin,DIG)标记核酸探针。
将DIG与dUTP交联,在参入核苷酸的标记反应中用DIG-11-dUTP(或DIG-11-UTP)取代dTTP(或rTTP),使探针DNA或RNA分子被DIG标记。
DIG标记的检测是该技术的核心,即利用抗DIG的抗体通过酶联免疫反应来完成。
将抗DIG的抗体与碱性磷酸酶偶联,通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处,在加入显色剂BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/盐酸氮蓝四唑)后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫色偏棕色沉淀,从而显示出目标分子的有无和位置。
图4-3是通过地高辛标记探针的Southern杂交实例。
M,地高辛(DIG)标记的分子量标准(lDNA/HindⅢ);
1-3,苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总DNA分别经KpnⅠ-PstⅠ、PstⅠ和KpnⅠ酶切。
以cry1Aa杀虫晶体蛋白基因中的728bp片段作探针,通过随机引物标记的方式,用DIG标记探针。
结果显示,该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因,而且其拷贝数明显不同。
预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。
图4-3:
通过地高辛标记探针的Southern杂交结果
通过放射自显影或生化检测,就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。
Southern杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因,以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。
应用该技术的前提是必须要有探针。
4.探针的标记
在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交来检测,但首先要有一段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。
将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交,通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。
用作检测的核酸片段即为探针(probe)。
4.1均匀标记
间接标记不是标记探针分子本身,而是复制一段新的探针分子,在复制过程中掺入标记的核苷酸(如[α-32P]dATP),从而使整个新分子被均匀地标记。
4.1.1
切口平移标记
这种标记方式目前只有通过大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ来完成,只有该酶具有5'
-3'
外切活性。
通过在待标记的DNA分子上产生切口,该酶引发5'
外切反应,在随后的5'
DNA聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸(dNTP),新合成的核酸链就带有标记物。
在整个标记反应体系中,待标记的DNA分子的任何一条链中的任何位点(除靠近5'
端外)都可能作为标记反应的起始点,并持续到该链的3'
末端。
因此,新合成的被标记的分子可以代表该待标记的DNA分子的绝大部分核苷酸序列。
4.1.2
随机引物标记
利用由6个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物,在Klenow酶的作用下对目标DNA进行随机扩增。
这样扩增出来的DNA产物包括从任意某个位点(可能最靠近5'
的一些核苷酸除外)起始的单链DNA片段,其整体应该包含了目标DNA所有核苷酸序列信息。
在扩增中加入标记的dNTP,扩增出来的DNA产物就可用作探针。
该方法多用来标记一个DNA片段。
4.1.3
PCR扩增标记
在PCR扩增时加入标记的dNTP,不仅能对探针DNA进行标记还可进行大量扩增,尤其适合于探针DNA浓度很低的情形。
4.2单链探针
4.2.1
单链DNA探针
单链DNA探针是通过单链模板来制备的。
首先将待标记的双链DNA连接到M13噬菌体载体或噬菌粒载体上,制备其单链DNA,然后以单链DNA为模板,以对应于载体上插入位点两端序列之一的通用引物为引物,在有标记的dNTP存在下,通过KlenowDNA聚合酶合成单链DNA。
经过分离纯化后即可得到高质量的带标记的单链DNA探针。
4.2.2单链RNA探针
在有些质粒载体的多克隆位点两端带有噬菌体的启动子,例如pGEM-3和pBluescriptⅡ系列载体分别含有T7/SP6噬菌体启动子和T7/T3噬菌体启动子。
将待标记的DNA片段插入载体的多克隆位点,在转录区下游选择一个酶切位点,用限制性内切酶将载体线性化以防止转录出载体的序列和多联体产物。
加入对应的噬菌体RNA聚合酶,rNTP和某个标记的rNTP在体外进行转录,合成出标记的单链RNA。
利用无RNA酶活性的DNA酶处理以及后续纯化步骤可获得纯化的单链RNA探针。
单链RNA探针的制备不仅比单链DNA探针更容易,而且其产生的杂交信号更强。
4.3末端标记
直接将探针分子的某个原子替换为放射性同位素原子,或直接在探针分子上加入标记的原子或复合物,这种直接标记一般是在探针分子的末端进行标记,亦称末端标。
4.3.1
DNA片段的末端标记
末端标记主要通过酶促反应来完成,但标记的方式很多。
如KlenowDNA聚合酶和T4或T7DNA聚合酶在对DNA片段进行末端补平反应或平末端的置换反应时可引入标记的核苷酸,T4多核苷酸激酶可在DNA的5'
末端引入标记的磷酸基团或将5'
末端的磷酸基团用标记的磷酸基团置换,末端转移酶可在DNA的3'
末端连接标记的核苷酸。
4.3.2寡核苷酸的标记
合成的寡核苷酸主要通过T4多核苷酸激酶在5'
末端引入标记的磷酸基团进行标记,也可利用末端转移酶在3'
二、原位杂交
原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上,或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落,对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来,并使之固定在滤膜上。
然后通过分子杂交,判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA。
菌落杂交主要用来从用质粒或Cosmid构建的基因文库中寻找阳性克隆子,当得到阳性克隆子后,再通过Southern杂交进一步验证。
通过这种方法在一张直径为9cm的滤膜上,可检测成几百到一千甚至上万个菌落,达到高通量筛选的目的。
三、斑点杂交
斑点杂交是分子杂交中最简单的一种,直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在滤膜上,然后进行分子杂交。
其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质等细胞成分的干扰小,其结果的可靠性更强。
当核酸分子的斑点面积变得更小,在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多,当检测的灵敏度进一步提高后,就发展成DNA芯片。
四、Northernblot
Northern杂交的总体过程与Southern杂交相似,只不过在Blotting过程中转移的是RNA而不是DNA,这种将RNA样品从凝胶转移滤膜的方法,其设计者为之起了一个与Southernblotting对应的名称,Northernblotting。
其后的分子杂交过程与Southern杂交过程中的分子杂交方式是一样的。
Northern杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子,从而判断在转录水平上某基因是否表达,在有合适对照的情况下,通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。
五、Westernblot
Western杂交的总体过程也与Southern杂交相似,只不过在Blotting过程中转移的是蛋白质而不是DNA,这种将蛋白质样品从SDS-PAGE凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法,称为Westernblotting。
其后的杂交过程不是真实意义的分子杂交,而是通过抗体以免疫反应形式检测滤膜上是否存在被抗体识别的蛋白质,并判断其分子量。
所用的探针不是DNA或RNA,而是针对某一蛋白质制备的特异性抗体。
Western杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质,从而判断在翻译水平上某基因是否表达。
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是,一方面可以避免非特异性的免疫反应,而且更关键的是可以检测出目标蛋白质的分子量,从而直观的在滤膜上显示出目标蛋白。
六、蛋白质N末端序列测定
七、RNA端点分析
1.RNA的S1核酸酶作图
对mRNA的端点进行分析之前必须知道mRNA的核苷酸序列,也就是必须获得该基因的核苷酸序列。
首先预先判断mRNA的端点位置,设计一段覆盖该端点的寡核苷酸,并作末端放射性标记。
然后将该标记的寡核苷酸与mRNA混合,退火,形成杂交体。
在S1核酸酶作用下,呈单链状态的DNA和RNA被降解,保留DNA-RNA杂交体双链,最后通过凝胶电泳检测DNA-RNA杂交体中标记的DNA单链的分子量大小,从而推断mRNA的末端序列。
其工作原理见图4-4。
这种方法既可以分析mRNA的5'
端也可分析3'
端。
2.引物延伸法分析mRNA的端点
引物延伸(primerextension)法主要用于mRNA的5'
末端作图,先要知道该基因的核苷酸序列并预先判断mRNA的端点位置。
首先在mRNA的预测的5'
末端下游约150bp位置处,设计一段互补寡核苷酸引物。
以mRNA作模板,用反转录酶延伸该引物,产生的cDNA与mRNA模板互补且其长度与引物5'
末端至mRNA的5'
末端之间的距离相等。
第五节生物芯片技术
一、生物芯片的定义
生物芯片(Biochip)是指通过机器人自动印迹或光引导化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微阵列,根据分子间的特异性相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于芯片表面,以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。
基因芯片(又称DNA芯片)是生物芯片的一种类型,它是将DNA分子固定于支持物上,并与标记的样品杂交,通过自动化仪器检测杂交信号的强度来判断样品中靶分子的数量,进而得知样品中mRNA的表达量,也可进行基因突变体的检测和基因序列的测定,为进一步了解基因间的相互关系及基因克隆提供有用的工具。
二、基因芯片技术的发展史
1989年英国牛津大学的Southern等取得了在刚性载体表面固定寡聚核苷酸及杂交法测序的专利;
与此同时俄罗斯和美国的科学家也提出了运用杂交法测定核酸序列(SBH)的设想。
1994年研制出了一种基因芯片并用于检测β-地中海贫血病的基因突变,筛选了一百多个β-地中海贫血病已知的突变基因。
1995年,一些国际大公司与研究机构合作共同开发具有商业价值的生物芯片及其相关的分析技术。
1997年世界上第一张全基因组基因芯片——含有6116个基因的酵母全基因组芯片在斯坦福大学Brown实验室完成。
从而使基因芯片技术在世界上快速得到应用。
三、基因芯片技术的特点
基因芯片技术的特点的核心是微型化。
芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个DNA片段、数万个基因。
一次分析可得到数万个基因的表达信息。
微型化的另一方面是样品用量与试剂用量的微量化,用纳克级的mRNA、微升级的杂交液就能分析成千上万个基因的表达信息。
这些都是其它研究技术所无法比拟的。
芯片制作及分析过程易于自动化。
芯片设计制作可实现自动化,可根据要求将需要分析的基因制作成符合要求的芯片;
杂交、洗片等过程都可实现自动化,工作效率大幅提高。
四、生物芯片的分类
1.按载体材料
按载体材料可将芯片分为玻璃芯片、硅芯片、陶瓷芯片。
目前,玻片材料因易得、荧光背景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。
通常是将玻片用化学方法处理并联接上活性基团,如氨基、醛基、巯基等,使生物分子通过共价键或离子键与载体结合。
2.按点样方式
根据芯片点样方式不同,可分为原位合成芯片、微矩阵芯片和电定位芯片三类。
①原位合成芯片(Loci-syntheticDNAChip)
②矩阵芯片(Microarray)
③电定位芯片(Microelectronic)
3.按芯
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- 第四 大分子 分离 分析