碱性磷酸酶km值测定实验报告Word文件下载.docx

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　　凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。

酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。

可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。

竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。

非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。

本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。

实验步骤：

　　实验一:

底物浓度对酶促反应速度的影响

　　1.取试管9支，将0.01mol/L基质液稀释成下列不同浓度：

　　管号

　　试剂

　　2.另取9支试管编号，做酶促反应：

　　3.混匀，37℃水浴保温5分钟左右。

　　4.加入酶液后立即计时，各管混匀后在37℃准确保温15分钟。

　　5.保温结束，立即加入0.5mol/Lnaoh1.0ml以中止反应。

各管分别加入0.3%4-氨基安替

　　比林1.0ml及0.5％铁氰化钾2.0ml。

　　6.充分混匀，放置10分钟，以管1为对照，于波长510nm处比色。

读取各管吸光度，

　　做记录。

（酶活性计算及Km值计算）

　　实验计算：

　　1.在37°

c下保温15分钟产生1mg酚为1个酶活性单位，从标准曲线查出释放的酚量（ug），

　　以此计算处各管的酶活性（v）。

　　2.以1/v为纵坐标、1/s为横坐标，在坐标纸上作图，求出酶的Km值。

　　Y=0.0581x+0.0242,Km=2.401

　　实验二:

抑制剂对酶促反映的影响

　　2.另取试管9支，做酶促反应：

　　并计算各管酶活性。

　　以酶活性单位（v）的倒数1/v为纵坐标，以底物浓度[s]的倒数1/s为横坐标，在方格纸上描点，并连接各点，求该酶的Km值并与前面未加入抑制剂时测出的Km值作比较。

　　Y=0.0832x+0.024,Km=3.47

　　实验分析：

　　通过绘图及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现，此抑制剂为竞争性抑制剂。

通过绘图发现，其两条以1/v为纵坐标、1/s为横坐标的直线截距几乎相同，而加入抑制剂后，酶的Km值更大，此为竞争性抑制剂的特征：

Vmax不变，Km变大。

　　思考题

　　一、除了双倒数作图外，你能举出其它能将酶动力学数据做出直线图的方法吗？

　　1.海涅斯-沃尔弗作图法（hanes-wolffplot）

　　双倒数方程式两边同时乘以[s]

　　直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km

　　2.伊迪-霍夫斯蒂作图法（eadie-hofsteeplot）

　　米氏方程式两边均除以[s]

　　直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为

　　Vmax

　　篇二：

碱性磷酸酶Km值得测定与分子筛层析

　　碱性磷酸酶Km值得测定

　　【实验（:

碱性磷酸酶km值测定实验报告）目的】

　　1.了解磷酸酶Km值的测定原理和方法；

　　2.掌握磷酸酶活性测定的原理和方法；

　　【实验原理】

　　1.在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随底物浓度

　　[s]增大而增加，但底物浓度增大到一定极限时，则反应速度趋于恒定，即最大反应速度（Vmax）。

反应速度与底物浓度之间的关系可用米氏方程来表示，即：

　　Vmax?

[s]V?

Km?

[s]

　　2.本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其底物，生成酚和磷酸盐。

酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色醌的额衍生物，根据红色的深浅可测出酶活力高低。

其反应如下：

　　磷酸苯二钠?

h2o?

?

苯酚?

na2hpo4

　　苯酚?

4-氨基安替比林?

醌类衍生物（红色）

　　【实验器材与试剂】

　　器材：

试管架，试管，移液管，移液枪，恒温水浴箱，721型分光光度计

　　试剂：

0.02mol/L底物液，ph=10碳酸缓冲液，蒸馏水，酶液，碱性溶液，4-氨基安替比林，铁氰化钾K3Fe（cn）6,oh?

AKp,oh?

　　【实验步骤】

　　试剂1234567空白0.02mol/L0.050.100.200.400.600.801.000.00底物液

　　ph=100.900.900.900.900.900.900.900.90碳酸缓冲液

　　蒸馏水0.950.900.800.600.400.200.001.00

　　混合水浴37℃，预温5分钟

　　酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1（0.5mg/ml）

　　加入酶液后立即混匀，37℃水浴保温，反应开始。

并开始计时，反应时间为15min

　　碱性溶液1.01.01.01.01.01.01.01.04-氨基安1.01.01.01.01.01.01.01.0替比林

　　铁氰化钾2.02.02.02.02.02.02.02.0混匀，室温放置10min左右，以空白管调零，

　　测定各管的吸光度（A510）

　　时间步骤现象分析

　　15:

50配好底物混合液无明显现象

　　并开始预热

55预热结束并加入酶液无明显现象

　　水浴15min

　　16:

07水浴结束，依次加入1-5号管红黄生成酚类碱性溶液等试剂，混颜色依次加深衍生物，匀，置于室温下10min6,7管颜色不深6,7号管反应未完全16:

17测定各管吸光度

　　【实验结果记录与处理】

　　试管编号12345678A5100.0300.0530.0970.1580.2320.1190.1280.0数据处理

　　试管编号12345678底物浓度0.51.02.04.06.08.0100mmol/L

　　1/[s]210.50.250.1670.1250.1001/A51033.3318.8710.316.334.318.407.810以1/[s]为横轴，1/A510为纵轴作图：

　　【计算】

　　根据y=15.071x+3.3668，当y=0时，x=-0.2234，继而Km=2.61mmol/L

　　【实践与思考】

　　1.底物浓度变化对酶促反应速度可造成什么样的影响？

　　在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。

如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，此时，无论底物浓度增加多大，反应速度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。

所有的酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同而已。

　　2.Km值在酶动力学研究中有什么意义？

　　不同的酶Km值不同,同一种酶与不同底物反应Km值也不同,Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小：

Km值大,表明亲和力小；

Km值小,表明亲合力大.

　　【注意事项】

　　1.计算出来的Km值与查资料所得到的值有一定的差距。

实验是粗测，本身存在实验误差，我们在操作过程中也造成误差，所以导致与实际值差距较大。

　　2.各管温度的时间一致。

　　分子筛层析（凝胶过滤法）

　　【实验目的】

　　1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理；

　　2.学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

　　1.凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体，它们的内部有很细微的多孔网状结构。

　　2.在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以至最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。

　　3.本实验采用葡聚糖凝胶g-25，以水为洗脱溶剂，层析分离大分子蓝葡聚糖（m>

200万）和小分子黄色重铬酸钾（m=294）。

　　【实验仪器与试剂】

　　仪器：

层析柱，试管架，铁架台，试管，小烧杯，胶头滴管试剂：

葡聚糖凝胶，蓝色葡聚糖，黄色重铬酸钾，蒸馏水

　　篇三：

实验名称碱性磷酸酶的分离纯化实验报告

　　实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期20XX年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师

　　总分教师签名批改日期

　　碱性磷酸酶（AKp或ALp）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

AKp具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。

AKp最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKp主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。

血清AKp主要来自肝，小部分来自骨骼。

　　AKp可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：

将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

　　一实验原理

　　1、碱性磷酸酶的分离纯化

　　AKp分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。

有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。

本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKp。

正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKp的滤液，AKp能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKp。

　　2、碱性磷酸酶的比活性测定

　　根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（u/mg?

pr）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：

a每毫升样品中的蛋白质毫克数；

b每毫升样品中的酶活性单位数。

酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：

在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。

样品蛋白质含量测定用Folin-酚法测定。

　　3、底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

　　在环境的温度、ＰＨ和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系表现为反应开始时。

酶促反应的速度（Ｖ）随底物浓度（Ｓ）的增加而迅速增加。

若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。

当底物浓度增加到某种程度时，反应速度就会达到一个极限值，即最大反引发速度（Vmax）。

底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用米氏方程式表

　　示：

　　式中：

Vmax为最大反应速度；

[s]为底物浓度；

Km为米氏常数；

V代表反应的起始速度。

①当ν=Vmax/2时，Km=[s]。

因此，Km等于酶促反应速度达最大

　　值一半时的底物

　　浓度。

　　②Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要的方法，大

　　多数酶的Km值在0.01-100mmol/L。

③Km和Vmax的测定：

主要采用Lineweaver-burk双倒数作图法。

此式为直线方程，

　　以不同的底物浓度1/s为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方

　　向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/Km，由此可以正确球的该酶的Km值。

方程式与图如下：

　　本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度时的酶活性，再根据Lineweaver-burk法作图计算其Km值。

实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

根据吸光值得大小可以计算出酶的活性，也可以从标准曲线上差得酚的含量，进而算出酶活性的大小。

　　二、实验材料

（一）碱性磷酸酶的分解纯化和比活性测定

　　１、样品兔肝２、试剂

　　①0.5mol/L乙酸镁溶液②0.1mol/L乙酸钠溶液

　　③0.01mol/L乙酸镁－0.01mol/L乙酸钠溶液

　　④0.01mol/LTris－0.01mol/L乙酸镁ph８.８缓冲液⑤丙酮（分析纯）⑥95%乙醇（分析纯）⑦正丁醇（分析纯）⑧0.04mol/L底物液⑨１mg/ml分标准液⑩0.5mol/LＮａＯＨ

　　?

0.3%4－氨基安替比林?

0.5%铁氰化钾

0.1mg/mL蛋白标准液?

碱性铜试剂

酚试剂３、仪器与器材

　　①研钵

　　②刻度离心管③刻度吸管

　　④电动离心机

　　⑤玻璃漏斗和玻璃棒⑥托盘天平⑦恒温水浴⑧可见分光光度计

（二）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

　　１、样品兔肝匀浆液

　　２、试剂

　　①0.04mol/L底物液

　　②0.1mol/L碳酸盐缓冲液ph10（37℃）③碱性溶液

　　④0.5%铁氰化钾⑤0.3%4－氨基安替比林⑥酚标准液（0.1mg/ml）３、仪器与器材

　　①恒温水浴锅

　　②可见光分光光度计

　　三、实验步骤

（一）AKp的提取

　　AKp提取实验步骤

（二）AKp的比活性测定

　　1、AKp的活性测定

　　AKp活性测定实验步骤

　　2、蛋白质含量测定

　　蛋白质含量测定实验步骤

　　（三）底物浓度对碱性磷酸酶活性的影响

　　1、底物浓度对酶促反应速度的影响

　　将新鲜兔肝用ph10.00.1mol/L碳酸缓冲液匀浆，按20倍稀释即可

　　酶曲线绘制步骤

　　2、酚标准曲线的绘制的绘制

　　酚标准曲线的绘制的绘制步骤