常用微生物染色方法.ppt

常用微生物染色方法.ppt

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常用微生物染色方法常用微生物染色方法泰兴市人民医院检验科微生物室刘鸿丽1、革兰染色2、抗酸染色3、墨汁染色革兰氏染色革兰氏染色原理革兰氏染色原理一通透性学说二等电点学说三化学学说G-/G+细菌细胞壁比较示意图细菌细胞壁比较示意图肽聚糖层肽聚糖层磷脂层磷脂层LPS磷壁酸磷壁酸革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌细胞壁细胞壁结构比较结构比较致密，肽聚糖层很厚，脂类含量致密，肽聚糖层很厚，脂类含量较少，酒精不易渗入，而且较少，酒精不易渗入，而且95酒精可使细胞壁脱水，间隙变小，酒精可使细胞壁脱水，间隙变小，通透性降低，阻碍通透性降低，阻碍结晶紫结晶紫-碘碘复合复合物渗出；物渗出；革兰氏阴性菌细胞壁结构比较革兰氏阴性菌细胞壁结构比较疏松，肽聚糖层很薄，外膜、脂疏松，肽聚糖层很薄，外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量蛋白、脂多糖均含有大量脂质脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫性增高，细胞内的结晶紫-碘复合碘复合物被酒精溶解洗出而脱色。

物被酒精溶解洗出而脱色。

原理原理一一一一通透性学说通透性学说通透性学说通透性学说二等电点学说三化学学说革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌等电点等电点（pH2-3）比革兰氏阴性菌等电点）比革兰氏阴性菌等电点（pH4-5）低，加之媒染剂）低，加之媒染剂碘为弱氧化剂能降低革兰氏碘为弱氧化剂能降低革兰氏阳性菌的等电点，因此在同阳性菌的等电点，因此在同样的样的pH的染色环境中，阳性的染色环境中，阳性菌所带菌所带负电荷负电荷比阴性菌多，比阴性菌多，与带正电荷的结晶紫染料能与带正电荷的结晶紫染料能牢固结合，不易被酒精脱色。

牢固结合，不易被酒精脱色。

原理原理一通透性学说二二二二等电点学说等电点学说等电点学说等电点学说三化学学说革兰氏阳性菌含有大量革兰氏阳性菌含有大量核糖核糖核酸镁盐核酸镁盐，其可与，其可与结晶紫结晶紫-碘碘结合成大分子复合物，因而结合成大分子复合物，因而不易被不易被95酒精脱色；而阴酒精脱色；而阴性菌中此物质含量较少，因性菌中此物质含量较少，因而吸附染料量很少，分子量而吸附染料量很少，分子量也较小，故易被酒精脱色。

也较小，故易被酒精脱色。

原理原理一通透性学说二等电点学说三三化学学说化学学说细菌涂片的制备细菌涂片的制备涂片涂片：

取一张洁净载玻片，用已灭菌的接种环取一环：

取一张洁净载玻片，用已灭菌的接种环取一环生理盐水于玻片中央，再将接种环灭菌，生理盐水于玻片中央，再将接种环灭菌，取菌与生理取菌与生理盐水磨匀盐水磨匀，涂布成，涂布成1cm1cm1cm1cm大小区域的均匀薄膜，使大小区域的均匀薄膜，使盐水磨成灰白色为宜，接种环灭菌后放回试管架。

盐水磨成灰白色为宜，接种环灭菌后放回试管架。

干燥干燥：

涂片最好在室温下自然干燥或将标本片涂抹面：

涂片最好在室温下自然干燥或将标本片涂抹面向上，置酒精灯火焰上半尺高处向上，置酒精灯火焰上半尺高处慢慢烘干慢慢烘干。

固定固定：

常用火焰加热法，手执载玻片一端，标本面向：

常用火焰加热法，手执载玻片一端，标本面向上，上，迅速来回通过火焰三次迅速来回通过火焰三次。

注意点注意点取菌量不可太多取菌量不可太多，涂片应均匀，否则影响染色结果，涂片应均匀，否则影响染色结果干燥时切忌高热干燥时切忌高热，以免细菌变形，以免细菌变形固定时温度不可过高时间不可长，以防涂抹面固定时温度不可过高时间不可长，以防涂抹面烧焦及玻片烧裂烧焦及玻片烧裂固定的目的固定的目的杀死细菌，使菌体蛋白凝固，染料易于着色杀死细菌，使菌体蛋白凝固，染料易于着色改变细菌通透性，以利于染料进入细胞内改变细菌通透性，以利于染料进入细胞内使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染料和水冲掉料和水冲掉BASO快速革兰染色快速革兰染色1.1.初染初染：

加龙胆紫液染色10秒，水洗，甩干2.2.媒染媒染：

加碘液数滴，染色10秒，水洗，甩干3.3.脱色脱色：

加脱色液脱色，不时摇动约1020秒，至无紫色脱落为止，水洗，甩干4.4.复染复染：

加沙黄溶液复染10秒，水洗，甩干5.吸水纸吸干，油镜观察标本注意事项1染液方面：

1）试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发。

2）脱色液用完后，可用丙酮作为代用脱色液，脱色时间可稍短。

3）试剂效期过后，请不要使用。

试剂盒储存时，尽量避免高、低温环境及阳光直射。

2涂片染色技术方面：

1）涂片不能太厚，太厚时常不易完全脱色，使阴性菌呈紫色。

2）涂片后最好自然干燥，若用火焰干燥或固定不能太靠近火焰，以免破坏菌体或炭化。

3）脱色时注意勿脱过头，使阳性变成阴性，尤其是链球菌很容易脱过头变成阴性。

4）染色时间要掌握好。

3.观察细菌形态或染色性不能用幼龄菌或衰老菌，一般采用培养16-18小时的菌落或菌液涂片染色。

革兰染色意义革兰染色意义鉴别细菌鉴别细菌革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌选择药物选择药物革兰氏阳性菌对青霉素等敏感革兰氏阳性菌对青霉素等敏感革兰氏阴性菌对链霉素等敏感革兰氏阴性菌对链霉素等敏感与细菌的致病性有关与细菌的致病性有关革兰氏阳性菌产生外毒素革兰氏阳性菌产生外毒素革兰氏阴性菌产生内毒素革兰氏阴性菌产生内毒素抗酸染色抗酸染色原理：

结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层类脂或脂质而不易着色，但一经着色后酸或已醇的作用亦是不易脱色。

利用此特性并以增强的染色液染色，然后再用酸及乙醇加处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色），而其他细菌及背景中的物质为蓝色。

操作步骤操作步骤1、涂片经火焰固定，加石碳酸复红溶液用火焰微热至出现蒸气约3分钟（防止染液蒸发干，必要时可续加第一液数滴，水洗。

2、用3%盐酸酒精脱色约1分钟，直至涂片无色或淡粉红色为止，水洗3、再加复染液复染1分钟，水洗，干后镜检。

结果判断结果判断抗酸杆菌呈红色，其他细菌及细胞呈蓝色。

注意事项注意事项1抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，发提高检出率。

染厚涂片时，须掌握复染时间，如果背景过深，会影响镜检。

痰标本找抗酸杆菌，应先高压杀菌，避免实验室污染。

2尿、粪中找到抗酸杆菌须作潘氏染色，排除耻后杆菌，才能报告。

标本中找到抗酸杆菌，须作传染病报告。

3离心应为3000转/分，30分钟。

4涂片至少保留三个月。

墨汁染色通常用于检查脑脊液或分泌物涂片中的隐球菌，具有方便、快速、节约成本等优点，是涂片中检查隐球菌感染的首选方法。

隐球菌：

显微镜暗视野（负染）下找隐球菌，可见圆形菌体，外周有一圈透明的肥厚荚膜，内有反光孢子，但无菌丝。

反复多次查找阳性率高，脑脊液应离心后沉淀涂片。

隐球菌墨汁染色阳性，需进一步做真菌培养操作步骤：

脑脊液等其他标本离心取沉淀物或者挑取菌液1环涂于沽净玻片上，然后加印度墨汁1环，覆以盖玻片后镜检。

镜下背景呈黑褐色，菌体无色透明。

结果判断新型隐球菌可呈宽阔透亮的厚荚膜，背景为纤细均匀的黑色，白细胞被染成黑色不透亮，但核形明显。

注意事项1、不要使用过期的印度墨汁。

2、墨汁应无污染、无颗粒等。