03薄层色谱法检验操作规程Word格式文档下载.docx

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高效薄层板所使用的固定相较普通薄层板平均粒度小，颗粒分布范围窄，因此在相对短的展开距离中可以达到更好的分离效果。

目前使用的薄层板有市售薄层板和自制薄层板两种。

一般市售薄层板分离效果较自制薄层板好。

如需特殊薄层板（如改性板）时，可采用自制薄层板。

2.2点样器

2.2.1手动点样主要用微升毛细管、微量注射器或配合与之相应的手动点样仪等。

2.2.2自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。

2.3展开容器又称展开缸，为大小适宜的密闭展开容器。

有双槽展开缸及平底展开缸等。

此外，也有自动展开仪器，可将薄层板按预定程序单次或多次展开，提高薄层展开的重现性。

2.4显色设备包括喷雾显色、浸渍显色以及蒸气熏蒸显色的设备。

2.4.1喷雾显色多用玻璃喷雾瓶或其它专用的喷雾设备，喷雾形成的雾滴应细小并且均匀。

2.4.2浸渍显色多在盛有显色剂的展开缸中进行。

2.4.3蒸气熏蒸显色可在密闭的展开缸、干燥器等设备中进行。

如薄层板需加热，可使用烘箱或专用的薄层加热台。

2.5检视和记录设备由暗箱及摄像设备组成。

2.5.1暗箱配备可见光、254nm和365nm紫外光光源以及相应的滤光片。

2.5.2摄像设备光学照相机、摄像头或数码相机等。

2.6薄层色谱扫描仪

薄层色谱扫描仪是薄层色谱定性定量分析的专用仪器。

主要由光源、单色器、薄层板台、检测器及工作站等组成。

有关内容详见薄层色谱扫描法标准操作规程。

3操作方法

3.1薄层板的制备和处理

除另有规定外，自制薄层板应采用大小为5cm×

20cm、10cm×

20cm、20cm×

20cm等规格的光滑平整玻璃板进行涂布。

涂布时，将1份固定相和3份水（或其他加有黏合剂的水溶液适量）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.25、0.3或0.5mm），将玻璃板取下，置水平台上室温下晾干，活化备用。

改性薄层板可在自制薄层板时加入改性剂，或用改性剂浸渍薄层板制备。

薄层板表面应均匀、平整、光滑，无麻点、无气泡、无破损及污染。

如果薄层板放置过久被杂质污染，可用氯仿、甲醇或二者的混合溶剂展开预洗。

铝箔片市售薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有破损。

市售薄层板和自制薄层板使用前一般应于110℃活化30分钟，活化后置干燥器中备用。

3.2点样

薄层点样应在洁净干燥的环境中进行。

点样方法有接触式点样和喷雾点样两种。

接触式点样时将吸有样品溶液的毛细管或针头与薄层板表面接触，从而使样品在薄层板上形成圆点状的点。

接触式点样应注意防止毛细管损伤薄层板表面。

喷雾点样时，点样针针杆匀速缓慢下推，针头部形成的小液滴被喷头喷出的气流吹落到薄层板上，机械控制薄层板匀速摆动，则形成均匀的条带状原点。

喷雾点样可提高点样的准确度与重现性，同时由于条带状原点的径向扩散较小，也可提高薄层色谱的分离度。

除另有规定外，用点样器吸取适量样品点样于薄层上，一般为圆点或窄细的条带状，点样基线距底边10mm～15mm，高效板一般基线离底边不大于8～10mm。

样点直径为一般不大于3mm，高效板一般不大于2mm；

点样时必须注意勿损伤薄层表面。

条带状宽度一般为5～10mm。

高效板条状带宽一般为4～8mm，可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。

点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。

市售高效薄层板载样量较普通薄层板小，容易引起过载，应适当调整点样量。

3.3展开选择大小适合的展开容器，将薄层板放入展开容器中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，展开。

一般上行展开8～15cm，高效薄层板上行展开5～8cm。

溶剂前沿达到规定展距，取出薄层板，晾干，待检测。

展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加入适量的展开剂，密闭，放置15～30分钟，待溶剂蒸气平衡后，迅速放入薄层板，立即密闭，展开。

也可使用双槽展开缸，在一侧槽内加入展开剂，薄层板置另一侧槽内，密闭容器，放置15～30分钟，再迅速将薄层板放入装有展开剂的展开槽内，密闭，展开；

或放置到规定时间后，保持容器密闭，小心倾斜展开容器，使展开剂进入到放置有薄层板的槽内，放平展开容器，展开。

3.4显色与检视

3.4.1直接检视在可见光下有颜色的供试品斑点可直接在日光下检视；

有荧光的供试品斑点可在紫外光灯254nm或365nm）下检视其荧光斑点；

在254nm紫外光下有吸收的物质可使用带有荧光剂的薄层板（如硅胶GF254板）展开后，再于254nm紫外光灯下观察其荧光淬灭所形成的色谱。

3.4.2显色后检视如供试品斑点不能直接检视，可喷以适宜显色剂或采用其它显色方法显色后再于可见光或紫外光下检视。

显色时应确保均匀。

渍溃显色应防止显色溶液溶解样品所造成的损失和色谱斑点变形。

3.5记录可使用光学照相机、摄像头以及数码相机等设备拍摄色谱结果，以光学照片或电子图像的形式保存。

在紫外光下拍摄时，光源发出的紫外光会干扰摄像设备感光，导致拍摄结果与肉眼观察存在一定的色差，应使用适当滤光片滤除紫外光。

可见光下进行检视的薄层板也可采用平板扫描仪记录薄层色谱结果。

如拍摄的图谱不能完全反映实际图谱的情况时，可另附手绘图谱。

4系统适用性试验

按各品种项下要求对色谱条件进行系统适用性试验，即用供试品和对照物对色谱条件进行试验和调整，应达到规定的检测灵敏度、分离度和重复性等要求。

4.1检测灵敏度系指用于限量检查时，被测成分能被检出的最低量。

一般采用供试品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。

4.2分离度用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液色谱中相应的主斑点，均应显示两个清晰分离的斑点。

用于薄层扫描仪扫描进行限量检查或含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：

R=2（d2-d1）/（W1+W2）

式中d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；

d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；

W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。

除另有规定外，分离度应大于1.0。

3.4.3重复性系指同一薄层板上同一供试品溶液相同浓度的数个斑点，扫描结果的偏差。

如薄层板展开后直接扫描，同一薄层板上平行点样的待测成分斑点（不少于4个点）的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；

如需显色后扫描，其相对标准偏差应不大于5.0%。

4.2比移值（Rf）计算从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值，按下式得出各斑点的（Rf）值。

Rf=d/d0

式中Rf为供试品的比移值；

d为斑点中心到基线的距离，mm；

d0为展开剂前沿到基线的距离，mm。

鉴别时，可用供试品溶液主斑点与对照品溶液主斑点的比移值进行比较，或用比移值来说明主斑点或杂质斑点的位置。

除另有规定外，比移值（Rf）应在0.3～0.7之间。

5测定法

5.1鉴别取适宜浓度的供试品溶液与对照品溶液，在同一块薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的位置（Rf）与颜色（或荧光）应与对照品溶液的主斑点一致，而且主斑点的大小、颜色的深浅也应大致相同。

或采用供试品溶液与对照品溶液等体积混合，应显示单一、紧密的斑点；

或选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试液的主斑点比较，两者Rf值应不同；

或将上述两种溶液等体积混合，应显示两个清晰分离的斑点。

5.2限量检查采用定量配制的对照品溶液为对照，供试品色谱中待检查的斑点与对照品色谱的相应斑点比较，其颜色（或荧光）和大小，不得更深（或不得更强）和更大。

5.3含量测定照薄层扫描法试验。

6注意事项

6.1薄层板的活化与保存自制薄层板和市售薄层板在使用前均应进行活化，活化后的薄层板应立即置于有干燥剂的干燥器中保存，保存时间不宜过长，最好随用随制，放入干燥箱中保存仅作为使用前的一种过渡。

6.2供试液的制备溶剂选择是否适当影响点样原点及分离后斑点的形状，一般应选择极性小的溶剂；

只有在供试品极性较大，薄层板的活性较大时，才选择极性大的溶剂。

除特殊情况外，试液的浓度要适宜，最好控制在使点样量不超过10μl（高效薄层板点样量不超过5μl）。

6.3点样薄层板上样品容积的负荷量极为有限，普通薄层板的点样量最好在10μl以下，高效薄层板在5μl以下。

点样量过多可造成原点“超载”，展开剂产生绕行现象，使斑点拖尾。

点样速度要快，在空气中点样以不超过10分钟为宜，以减少薄层板和大气的平衡时间。

点样时必须注意勿损坏薄层表面。

待溶剂挥散后方可展开。

6.4点样环境实验环境的相对湿度和温度对薄层分离效果有着较大的影响（实验室一般要求相对湿度在65%以下为宜），因此应保持试验环境的相对恒定。

对温、湿度敏感的品种必须按品种项下的规定，严格控制实验环境的温、湿度。

6.5展开展开缸预先饱和可避免边缘效应，展开距离不宜过长，通常为10cm以下。

方法二（中国药典2010年版二部）

薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上，经展开、检视所得的色谱图，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用于药品的鉴别或杂质检查的方法。

2.1.1自制薄层板除另有规定外，玻板要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H和硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。

其颗粒大小，一般要求直径为5～40$μm。

2.1.2市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜和铝基片薄层板等。

2.2点样器有手动、半自动或自动点样器，一般采用微量注射器或定量毛细管。

2.3展开容器应使用适合薄层板大小的专用薄层色谱展开缸，并有严密的盖子，底部应平整光滑，或有双槽。

2.4显色剂按各品种项下规定。

可采用喷雾显色、浸渍显色或置碘蒸气中显色，检出斑点。

2.5显色装置喷雾显色可使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；

浸渍显色可用专用玻璃器皿或适宜的玻璃缸代替；

碘汽熏碘显色可用双槽玻璃缸或适宜大小的干燥器代替。

2.6检视装置为装有可见光、短波紫外光（254nm）、长波紫外光（365nm）光源及相应滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄色谱图用，暗箱内光源应有足够的光照度。

3.1薄层板制备

3.1.1自制薄层板除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（层厚为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃活化30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。

薄层涂布，一般可分无黏合剂和含黏合剂两种；

前者系将固定相直接涂布于玻板上，后者系在固定相中加入一定量的黏合剂，一般常用10%～15%煅石膏（CaSO4·

2H2O在140℃加热4小时），混匀后加水适量使用，或用0.2%～0.5%羧甲基纤维素钠水溶液（取羧甲基纤维素钠适量，加水适量，放置使溶胀，加热煮沸至完全溶解，放置，取上清液，即得）适量，在研钵中沿同一方向研磨混合调成糊状，去除表面的扣帽泡后，均匀涂布于玻板上。

晾干，活化后，备用。

使用涂布器应能使固定相在玻板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视），表面应均匀、平整、光滑，无麻点，无气泡，无破损及污染。

3.1.2市售薄层板临用前一般应在在110℃活化30分钟。

聚酰胺薄膜不需活化。

铝基片薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的层板底边的硅胶层不得有破损，如在储放期间被空气中杂质污染，使用前可用适宜的溶剂在展开容器中上行展开预洗，110℃活化后，放在干燥器中备用。

3.2点样除另有规定外，在洁净干燥的环境下，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，应能使点样位置正确、集中。

点样基线距底边2.0cm（高效薄层板一般为0.8～1.0cm），点样直径为2～4mm（高效薄层板一般不大于1～2mm），点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般为1.0～2.0cm（高效薄层板一般不少于5mm）。

点样时必须注意勿损伤薄层板表面。

3.3展开展开缸如需预先用展开剂饱和，可在缸中加入足够量的展开剂，并在壁上贴两条与缸一样高、宽的滤纸条，一端浸人展开剂中，密封顶盖，一般保持15～30分钟，使系统平衡或按品种规定操作。

将点好样品的薄层板迅速放人展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点0.5～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封顶盖，待展开至规定距离（一般为10～15cm,高效薄层板一般为5cm左右），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测。

展开可以向一个方向进行，即单向展开；

也可以进行双向展开，即先向一个方向展开，取出，待展开剂完全挥发后，将薄层板转动90°

，再用原展开剂或另一种展开剂进行展开；

亦可多次展开。

3.4显色与检视荧光薄层板可用荧光淬灭法；

普通薄层板，有色物质可在日光下直接检视；

无色物质可用物理或化学方法检视。

物理方法是检出斑点的荧光颜色及强度；

化学方法一般用化学试剂显色后，立即覆盖同样大小的玻板，在日光下检视。

按各品种项下要求对检测方法进行系统适用性试验，检测斑点的检测灵敏度、比移值（Rf）和分离效能应符合规定。

4.1检测灵敏度用于杂质检查时，采用对照溶液经稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照溶液在规定的色谱条件下，在同一块薄层板上点样、展开、检视，前者应显示清晰的斑点。

除另有规定外，比移值（Rf）应在0.2～0.8之间。

4.3分离效能鉴别时，对照品与结构相似的药物对照品制成的混合对照溶液按规定方法展开后，应显示两个清晰分离的斑点。

杂质检查时，杂质对照品与主成分制成的混合对照溶液按规定方法展开后，应显示两个清晰分离的斑点，或待测成分与相邻的斑点应清晰分离。

5.1鉴别可采用与同浓度的对照品溶液，在同一块薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显主斑点的位置（Rf）与颜色（或荧光）应与对照品溶液的主斑点一致，而且主斑点的大小、颜色的深浅也应大致相同。

5.2杂质检查，可采用杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法或杂质对照品法与供试品溶液自身稀释对照法并用。

供试品溶液除主斑点外的其他斑点应与相应的对照品溶液或系列对照品溶液的主斑点比较，或与供试品溶液的自身稀释对照溶液或系列自身稀释对照溶液的主斑点比较，不得更深。

通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量，当采用系列自身稀释对照溶液时，也可规定估计的杂质总量。

6.2供试液的制备溶剂选择是否适当影响点样原点及分离后斑点的形状，一般应选择极性小的溶剂；

6.5展开展开缸预先饱和可避免边缘效应，展开距离不宜过长，通常为10～15cm。