第五章种子生活力和活力测定Word格式文档下载.docx
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根据1996国际种子检验规程,四唑测定适用于下列范围:
(p61)
(1)测定深度休眠种子;
收获后需马上播种的种子;
发芽缓慢的种子;
要求估测发芽潜力的种子。
另外,也适用于:
(2)测定发芽末期未发芽种子的生活力,特别是怀疑有休眠时。
(3)测定种子收获或加工过程中的种子损伤的原因(如热害、机械损伤、虫蛀等)。
(4)解决发芽试验中存在的问题,如查明不正常幼苗产生的原因;
怀疑杀菌剂、种子包衣的处理效果等。
(二)、四唑测定法的原理
有生活力的种子活细胞内有脱氢酶,可与氧化还原反应指示剂:
四唑(无色)反应而显色,被还原成为红色、稳定的三苯基甲腊(triphenylformazam)。
可根据四唑染成的颜色和部位,区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。
除了完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外,还可能出现一些部分染色的种子。
说明在不同部位存在面积大小不同的坏死组织。
判断种子有无生活力,主要看胚和胚乳不染色坏死组织的部位及面积大小,而不完全取决于染色的深浅。
染色的深浅可以区别健壮程度。
即染色愈深,种子生活力愈旺盛。
四唑染色是一酶促反应,反应不仅受酶活性的影响,还受底物浓度、反应温度、pH等因素的影响。
(三)、四唑测定法应用的化学试剂
1、四唑
四唑盐类有多种,常用的是2,3,5—氯化三苯基四氮唑,
{英文2,3,5—triphenyltetrazo1iumchloride},缩写为TTC。
(1)特性
①白色或淡黄色粉剂,易溶于水,有微毒,使用时不要接触(少接触)。
②见光易被还原成粉红色,需用棕色瓶包装,再裹一层黑纸。
同样,配好的四唑溶液也应装入棕色瓶里,暗处保存,种子染色也需在暗处和弱光处进行。
(2)四唑液浓度
常用的四唑染色浓度为%~%(m/v).一般来说:
切开种胚的种子可用%~%的四唑溶液;
整个胚、整粒种子需用%的四唑溶液。
(3)pH:
四唑溶液的pH要求在~,若溶液的pH不在此范围,反应不能正常进行。
因此,对于游离酸含量高的四唑应当用缓冲液配制。
即一般国产的四唑游离酸含量高,要用缓冲液配制(进口的可直接用蒸馏水配制)。
配制方法:
称取lg(或0.1g)四唑粉剂溶解于100mL磷酸缓冲液中,即配成%(或%)的四唑溶液;
当用酸度计测定时,若四唑液的pH值达不到要求,则可用稀NaOH或NaHCO3溶液加以调节。
配好的四唑溶液应保存在棕色瓶里,一般有效期可保持数个月。
若存放在冰箱里,有效期更长。
2、磷酸缓冲液:
其配方如下:
(1)ISTA及GB规程法:
首先配两种溶液,然后按比例混合即成。
溶液I:
称取9.078gKH2PO4(磷酸二氢钾)溶解于l000ml蒸馏水中;
溶液Ⅱ:
称取9.472gNa2HPO4(磷酸氢二钠)
或溶解于1000mL蒸馏水之中。
然后取溶液I:
2份和溶液Ⅱ:
3份混合即成。
以上比较麻烦,也可用北美官方种子检验规程:
(2)AOSA规程法:
在1000mL蒸馏水中加入5.450gNaH2PO4和3.790gNa2HPO4充分溶解即成。
3、乳酸苯酚透明液:
用于染色后的小粒豆类和牧草种子,经四唑染色后使种皮、稃壳或胚乳变得透明,以便透过这些部分清楚地观察其胚的染色情况。
配法:
20mL乳酸+20mL苯酚(若苯酚是结晶形式,则需溶化为液体)+40mL甘油+20mL蒸馏水混合而成。
该药液有毒性,在使用时防止触及皮肤或衣服等。
配制时最好戴塑胶薄膜手套,并在通风橱里操作。
(四)、四唑测定法的程序参照96版《国际种子检验规程》及95GB:
1、试验样品:
随机数取净种子100粒,2~4次重复(GB2~4次重复,
ISTA4次重复)
2、种子预处理(预措预湿)
(1)目的:
大部分种子在测定前都需经过预处理。
目的:
使种子加快和充分吸湿,软化种皮,方便样品准备,促进酶的活化,以提高染色的均匀度、鉴定的可靠性和正确性。
因为种子吸湿后,切开、针挑种皮或切开营养组织变得容易,
而干种子则工作困难,并且活细胞内的酶尚未活化,染色效果不良。
因此,预措预湿对正确测定是很重要的。
(2)预措:
指在种子预湿前除去种子外部的附属物。
包括剥去果壳和
在种子非要害部位弄破种皮。
如水稻种子需脱去稃壳;
花生剥去果壳;
豆科硬实种子需刺破种皮等。
注意:
预措不能损伤种子内部胚的主要构造。
而大多数种子则不需
预措处理。
(3)预湿:
是四唑染色测定的必要步骤。
因为吸账种子一般比干种子不易破碎,比较容易切开或刺破种皮。
目前常用预湿方法有二种:
①缓慢吸湿:
将种子放在纸上或纸间吸湿。
适用于:
直接浸在水中容易破裂的种子;
已经劣变的种子(陈种子);
过分干燥的种子。
缓慢吸湿,能较好地解决吸湿和供氧的矛盾。
GB规定:
像大豆、菜豆、葱、花生等种子要求缓慢纸床预湿。
禾谷类种子既可水浸预湿,也可缓慢纸床预湿。
缓慢预湿可采用下面两种方法:
a纸床上预湿:
小粒豆类种子,如苜蓿、三叶草等种子。
b纸卷或纸间预湿:
像大豆、菜豆、豌豆等种子。
②快速水浸预湿:
将种子完全浸入水中,充分吸胀。
因为种子直接浸入水中,吸水快、吸水均匀,可缩短预湿时间。
适用于种子直接浸入水中,不会造成组织破裂的种子。
包括水稻、
麦类、玉米等。
浸种温度一般采用20℃~30℃水温。
具体种类和浸种时间见《农作物种子四唑染色技术规定》。
3、染色前的种子处理
种子在染色前需将胚的主要构造和活的营养组织暴露出来,
利于四唑溶液渗透,便于正确鉴定。
(p63图5-1)表明种子不同切法的部位,常见的有以下几种:
(1)不须样品准备:
a、种皮渗水性良好的小粒豆类种子(如紫花苜蓿和小扁豆等),染色时就能随着四唑溶液的渗入而吸胀,并在染色后剥去种皮就可正确鉴定。
这类种子不须样品准备。
b、大粒豆类:
可采用缓慢吸湿后不须样品准备。
(如菜豆和大豆等)
但在染色后观察鉴定前也需剥去种皮,以便鉴定更为可靠。
(2)沿胚纵切取半粒:
适用于具有直立胚的大粒禾本科种子。
如玉米、麦类和水稻等种子。
方法:
沿胚纵切,使胚的主要构造暴露出来,取其一半用于染色观察。
(3)剥去种皮:
棉花、十字花科种子需剥去种皮或内膜;
瓜类也剥去种皮。
方法是:
将预湿后的整个种皮剥去。
4、四唑染色
将处理好的种子放在小烧杯内,然后加入适宜浓度的四唑溶液,以淹没种子为度,移至一定温度的黑暗恒温箱内进行染色反应。
染色时间:
因种子种类、样品准备方法、生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH值和温度等因素的不同而有差异,其中温度影响最大。
在20~45℃范围内,温度每增加5℃,其染色时间可减少一半。
例如:
30℃适宜染色时间为6h,
35℃则只需染色反应3h,
40℃下仅需。
一般选择35℃
35℃染色:
玉米、麦类等禾谷类种子~1h
豆类种子3~4h
剥去种皮染色的种子2~3h
具体见《农作物种子四唑染色技术》。
达到规定时间或染色已很明显时,倒去四唑液,用水冲洗。
如果到达规定时间种子染色仍不够完全,可适当延长染色时间。
5、鉴定前处理书上复杂
不进行处理的种子,观察前要适当处理使胚部暴露出来,具体处理方法规程中都有:
(读本p201-204)
如一些小粒豆类、棉籽沿胚中轴纵切;
瓜类除去种皮和内膜;
大粒豆类(大豆、菜豆、花生):
除去种皮,掰开子叶,露出胚芽。
大粒种子可直接用肉眼或放大镜观察;
小粒种子最好用10~100倍体视镜观察。
6、观察鉴定
测定结果的可靠性取决于检验人员对染色组织和部位的正确识别、工作经验等综合运用能力。
观察鉴定的主要目的是区别有生活力和无生活力种子。
(1)一般鉴定原则:
a、凡是胚的主要构造染成鲜红色,为有生活力种子。
b、凡是胚的主要构造局部不染色,不染色部分超过允许范围,
为不正常种子。
c、凡是完全不染色的为死种子。
不正常种子和死种子均作为无生活力种子。
(2)观察的部位:
①禾谷类:
主要观察胚芽、胚轴、胚根、盾片。
鉴别标准:
除完全染色的为有生活力种子外,下列有残缺的种子也有生活力:
a、盾片上部或下部任一端不染色的部分<1/3
b、胚根的顶端:
玉米1/3不染色;
水稻、高粱2/3不染色;
麦类大部分不染色,但不定根的原始体须染色。
理解:
胚芽必须染色,胚根不染色可以长出次生根。
②豆类:
有生活力的种子允许不染色的最大面积:
a、胚根顶端不染色:
花生为1/3;
蚕豆为2/3;
其他为1/2.
b、子叶顶端不染色:
花生为1/4;
蚕豆为1/3;
c、胚芽顶端不染色1/4,蚕豆除外。
③瓜类:
胚根顶端不染色允许1/2;
子叶顶端不染色允许1/2。
(胚芽必须染色)
④其他种属:
(棉属、芸苔属等)
胚根顶端1/3不染色;
子叶顶端1/3不染色。
P70图5-2小麦种子四唑测定结果的鉴定标准(单子叶):
图中黑色部分表示染成红色,有生活力组织,白色部分表示不染色的死组织。
1-6有发芽力:
1.整个胚染成鲜红色;
2~5.盾片末端不染色;
6.胚根尖端不染色;
7-16无发芽力:
7.胚根3/4以上不染色8.胚芽不染色;
(一点也不行)
9.盾片中部和盾片节不染色;
10.胚轴不染色;
11.盾片末端和胚芽尖端不染色;
12.胚的上半部不染色;
13.盾片不染色;
14.盾片、胚根和胚根鞘不染色;
15.染成模糊的淡红色;
16.整个胚不染色。
图5-3大豆种子四唑测定结果的鉴定结果标准
1-3有发芽力:
1.胚染成鲜红色;
2.仅子叶远离胚芽部分少量未染色;
3.仅子叶下部和边缘少许不染色;
4-6无发芽力:
4.子叶上部重要部位未染色;
(面积少也不行)
5.胚根主要部位不染色;
6.子叶一半以上未染色。
表1农作物种子四唑染色技术规定
种名
预湿方式及时间h
染色前的准备
浓度
%
35℃染色时间,h
鉴定前的处理
有生活力种子允许不染色、较弱或坏死的最大面积
备注
小麦
大麦
黑麦
纸间或水中30°
C恒温水浸种3-4h,或纸间12h
a.纵切胚和四分之三胚乳。
b.分离带盾片的胚
a.观察切面
b.观察胚和盾片
a.盾片上下任一端三分之一不染色。
b.胚根大部分不染色,但不定根原始体必须染色
盾片中央
有不染色
组织,表
明受到热
损伤
玉米
同上
纵切胚和大部分胚乳。
观察切面
胚根;
盾片上下任一端三分之一不染色
高粱
纵切胚和大部分胚乳
a.胚根顶端三分之二不染色。
b.盾片上下任一端三分之一不染色
水稻
纸间或水中
12
纵切胚和四分之三胚乳
胚根顶端三分之二不染色
必要时可
除去内
外稃
棉花
纸间
a.纵切二分之一种子。
b.切去部分种皮。
c.去掉胚乳遣迹
2-3
纵切
a.胚根顶端三分之一不染色。
b.子叶表面有小范围的坏死或子叶顶端三分之一不染色
有硬实应
划破种皮
菜豆
豌豆
绿豆
花生
大豆
豇豆
扁豆
蚕豆
纸间6-8
无须准备
3-4
切开或除去种皮,掰开子叶,露出胚芽
a.胚根顶端不染色,花生为三分之一,蚕豆为三分之二,其他种为二分之一。
b.子叶顶端不染色,花生为四分之一,蚕豆为三分之一,其他为二分之一
c.除蚕豆外,胚芽顶部不染色四分之一
南瓜
丝瓜
黄瓜
西瓜
冬瓜
苦瓜
甜瓜
纸间或水中在20-30°
C水中浸6-8h或纸间24h
b.剥去种皮。
c.西瓜用干燥布或纸揩擦,除去表面粘液
2-3h,但甜瓜1-2h
除去种皮和内膜
a.胚根顶端不染色二分之一。
b.子叶顶端不染色二分之一。
白菜型油菜
不结球白菜
结球白菜
甘蓝型油菜
甘蓝
花椰菜
萝卜
芥菜
30°
C温水中浸种3-4h或纸间5-6h
a.剥去种皮。
2-4
a.纵切种子使胚中轴露出。
b.切去部分种皮使胚中轴露出
b.子叶顶端有部分坏死。
葱属(洋葱、韭菜、葱、韭葱、细香葱)
纸间12
a.沿扁平面纵切,但不完全切开,基部相连。
b.切去子叶两端,但不损伤胚根及子叶。
扯开切口,露出胚。
b.切去一薄层胚乳,使胚露出
a.种胚和胚乳完全染色。
b.不与胚相连的胚乳有少量不染色
辣椒
甜椒
茄子
番茄
纸间水中在20-30°
C水中3-4h,或纸间12h
a.在种子中心刺破种皮和胚乳。
b.切去种子末端,包括一小部分子叶
撕开胚乳,使胚露出。
b.纵切种子使胚露出
胚和胚乳全部染色
芫荽
芹菜
胡萝卜
茴香
水中
在20-30°
C水中3h
a.纵切种子一半,并撕开胚乳,使胚露出。
b.切去种子末端四分之一或三分之一
进一步撕开切口,使胚露出。
b.纵切种子露出胚和胚乳
苜蓿属
草木樨属
紫云英
水中22
除去种皮使胚露出
b.子叶顶端三分之一,如在表面可二分之一不染色。
莴苣
茼蒿
水中在30°
C水中浸2-4h
a.纵切种子上半部(非胚根端)。
b.切去种子末端包括一部分子叶
a.切去种皮子叶使胚露出。
b.切开种子末端轻轻挤压,使胚露出。
b.子叶顶端二分之一表面不染色,或三分之一弥漫性不染色
向日葵
水中3-4
纵切种子上半部或除去果壳
除去果壳
b.子叶顶端表面二分之一不染色。
甜菜
水中18
a.除去盖着种胚的帽状物。
b.沿胚与胚乳之界线切开
扯开切口使胚露出
b.子叶顶端三分之一不染色。
菠菜
a.在胚与胚乳之边界刺破种皮。
b.在胚根与子叶之间横切。
a.纵切种子,使胚露出。
b.掰开切口,使胚露出。
同上
7、结果计算与处理
根据样品胚部的显色情况,分别计算各重复有生活力种子的百分率。
GB/对试验样品的规定至少200粒:
即2~4次重复。
查重复间的最大允许差距:
X1X2X3X4→求平均数
(GB:
但生活力有二、三次重复值;
而发芽试验无二、三次重复值)
X最大-X最小与容许差距比较:
>容许差距重作;
≤容许差距结果正确用
表示。
【例】测某种子生活力,三次重复95%、96%、98%。
=%;
98-95=3<容许差距7。
若测二次重复:
95%、99%。
=97%99-95=4<容许差距6。
表2生活力测定重复间的最大容许差距GB/
平均生活力百分率%
重复间容许的最大差距
1
2
4次重复
3次重复
2次重复
99
5
-
98
3
6
97
4
7
96
8
95
9
93-94
7-8
10
91-92
9-10
11
90
89
88
13
87
14
84-86
15-17
81-83
18-20
15
78-80
21-23
16
76-77
24-25
17
73-75
26-28
71-72
29-30
18
69-70
31-32
67-68
33-34
64-66
35-37
19
56-63
38-45
55
46
20
51-54
47-50
(五)注意事项:
纵切禾谷类种胚时,一定要沿胚中部纵切,使切面显示胚的各部分构造,否则会出现鉴定误差。
1、若切面不正
若保留大的:
胚芽是完整的,染色时间短,胚芽可能不染色。
其他地方染色均匀,也属正常有生活力的种子。
若保留小的:
胚芽与盾片有缝,只要其他部分染色深、均匀,
也有生活力。
2、切面粗糙:
切时剥开,部分细胞被撕开,细胞被破坏,表层细胞不染色。
所以切面要光滑。
这时染成乳白色与不染色是有区别的。
(p71离体胚培养法:
主要测定发芽缓慢或休眠期长的种子生活力,主要用于林木种子,农作物种子用的少。
四、染料染色法(GB中无,了解)同p73
(一)测定原理(TTC法:
活细胞染成红色;
本法相反:
活细胞不染色)
有生活力的种子,其活细胞原生质膜具有选择透性,当种子浸入染料后,染料大分子不能进入活细胞内,其胚部活组织不能被染料染色;
而死的种胚原生质膜丧失选择吸收能力,故可被染料染色。
(二)测定方法
1、靛蓝染色法
适用于豆类、谷类、棉花、瓜类和林木等大粒种子的生活力测定。
试剂为靛蓝:
蓝色粉剂,能缓慢溶于水。
测定方法如下:
(1)种子预处理:
(100粒×
2次)
先将种子去壳,浸入30℃水中,充分吸账。
浸种时间:
小麦、大麦、大豆、豌豆和向日葵等为3h,
燕麦、芝麻等4h;
油菜、花生、棉籽等6h,
蓖麻、红麻、大麻等7h;
黍8h;
水稻12h;
玉米20h。
然后,禾谷类沿胚中线纵切;
双子叶种子剥去种皮,以备染色用。
(2)靛蓝染色:
将处理好的种子置于小烧杯内,加入靛蓝溶液淹没种子。
浓度:
纵切种子用%溶液,剥去种皮种子用%溶液。
染色时间:
禾谷类为15min,
油菜、芝麻、红麻和大麻等30min,
大豆、亚麻、向日葵、蓖麻、花生和棉籽等60min,
豌豆3h。
(3)观察鉴定:
取出种子,用清水冲洗后立即进行观察鉴定。
凡种胚不染色或染成浅蓝色的、胚根尖端或少部分子叶染色的,
为有生活力种子;
凡种胚全部染成蓝色的,或胚根、胚轴、胚芽、子叶等大部分染成
蓝色的,为无生活力种子。
2.红墨水染色法
测定原理、种子预处理、染色时间等与靛蓝染色法基本相同。
不同点:
染成的颜色不同,死胚染成红色,活种子胚不染色。
测定时用刚开瓶的红墨水,红墨水与水的比例:
小麦、玉米、大豆和棉花等为1:
60;
大麦以1:
120为宜。
到达规定染色时间后取出种子,用清水冲洗,立即鉴定。
五、软X射线造影法(检验员读本无)
《1996国际种子检验规程》增加了X射线测定技术,国内没列入国标(国标为93规程)。
软X射线波长较长,为~,穿透力弱。
(机械工业部)湘西探伤厂产的HY-35型农用X光机。
主要用于:
作物种子成熟度的观察(水稻、花生)
种子隐蔽害虫的检验(进口林木种子隐蔽害虫)
农作物种子生活力测定(软X射线渗钡造影法)
(一)测定原理
活细胞的原生质膜具有选择透性,而死伤组织丧失选择透性。
用氯化钡(BaCl2)溶液浸种渗透后:
凡有生活力的种子不吸收钡(Ba++)离子;
无生活力的种子钡(Ba++)就会渗入种子细胞内部。
软X射线造影时,由于重金属离子能强烈吸收x射线:
把这种渗钡状况不同的种子置于软X光机曝光造影:
在荧光屏上(印成相片后):
死伤组织,渗入钡离子吸收了X射线,较为黑暗;
活种子较为明亮。
在底片上相反:
死组织较透明;
而活组织较为黑暗。
(二)测定方法
1.种子预湿
随机数取净种子200粒,每重复50粒。
在室温下清水中浸泡2~16h充分吸账;
对直接浸水容易破裂的种,可先进行缓慢预湿后再浸泡16h,然后取出种子用滤纸吸去种子表面的水分。
2.造影剂处理
凡不能透过
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