SDSPAGE失败案列与分析Word格式.docx

SDSPAGE失败案列与分析Word格式.docx

《SDSPAGE失败案列与分析Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《SDSPAGE失败案列与分析Word格式.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

上图中4、7道的蛋白样品虽然含有一样的蛋白量，但是第4道的样品中含有的膜蛋白的量超过了凝胶的分辨能力，造成了很深的涂抹痕迹。

病症2——条纹拖尾

条纹拖尾——例1

这个不是非常严重，有条纹拖尾的泳道〔图中左边第5道〕也是可以用的。

条纹的出现是由于一局部膜组分中的高浓度蛋白在跑积层胶过程中析出然后在很短的时间里又回到溶液中。

由于别离胶外表存在轻度的缺陷〔可能是在倒积层胶之前别离胶干了一些〕，造成整个泳道的蛋白浓度的不一致，使得出现这种条纹拖尾病症，而不是一致的很深的背景。

条纹拖尾——例2

第4道也是由于上述原因而出现条纹拖尾。

电场受到了第4道非均一浓度的影响而出现了条带的缩窄。

注意凝胶前端染料的缺失，是由于电泳时间过长所致。

条纹拖尾——例3

这块胶就非常难看了。

原因在于别离胶倒完之后没有用水或者异丙醇压胶，导致别离叫上缘非常粗燥，就像你看到的一样。

当样品堆积在凹凸不平的分界限时，位于凹陷部位的蛋白由于不能适当的浓缩就析出来了。

然后再跑胶过程中逐渐溶解造成了条纹拖尾病症。

病症3——条带过浅

条带过浅——例1

这个问题可能是由于加样孔成形不佳和/或凝胶加样不认真所致。

背景较深而且不均一说明蛋白可能存在于电泳缓冲液中。

最有可能原因是由于装置没有正确严密的装配导致较多的样品溢出加样孔。

溢出的样品很可能不会重新溶入形成条带，因为这些蛋白从上层缓冲液的间隔持续进入凝胶。

注意在凝胶下部存在一条贯穿假设干泳道的水平线，说明加样孔太浅，局部样品溢出至相邻的加样孔。

这个病症在一些配制正确的凝胶中也会出现，常常是在电极连通之后的数分钟内。

蛋白溢出至加样孔外而不是进入积层胶。

在几分钟之内发现问题可能挽救一局部损失，但是由于PH效应导致有效的样品浓缩失败，样品损失以及蛋白污染电泳缓冲液。

条带过浅——例2

由于没有其他的病症，这块胶的问题似乎仅仅就是染色出问题了。

考马斯亮蓝染液如果反复利用就会被SDS污染，这些回收的染液对于蛋白的染色效率就不及新鲜配制的染液。

只要样品蛋白被染液中酸化的甲醇固定于胶上，那么这个问题只需要简单的重新用新鲜配制的染液染色剂可解决。

条带过浅——例3

第五道旁边用"

X〞标记的泳道的样品蛋白含量被低估了，或者电泳样品准备时弄错了样品浓度，或者上样体积太少——可能是加样针没有正确的吸取足够的样品。

和其它的样品比照，缺乏几乎所有的主要的条带，说明这个孔的问题就是上样量过低。

条带过浅——例4

这是你可能遇到的问题中比较让人沮丧的。

我们可以说你是非常仔细的，把每件事都做得倾向于完美，跑胶直到溴酚蓝前沿非常平直的落在胶的最底部。

你用去离子水冲洗凝胶，然后将其置于摇床震荡。

在这天稍晚些时候你发现你忘了将凝胶放到染色缸里面。

第二天染色结果就是上面的样子了。

注意分子量较小的蛋白从胶上弥散较快，而较大分子量的蛋白弥散很慢而能被染色。

染色和脱色液中的酸化甲醇是非常必要的，它可以固定蛋白阻止其从聚丙烯酰胺基质上弥散。

病症4——前端指示剂缺失

局部前端指示剂——例1

为了装置凝胶花了不少功夫，如果停顿电泳太晚就太可惜了。

因为如果局部前端的指示剂已经跑出凝胶的话就不能确定各个条带相对应的迁移率了。

这块胶有一个内部的刻度——也就是跑胶时带上了分子量标准〔Marker〕。

由于条带较平直，任意条带都可以作为参考来确定跑胶的迁移率。

前端指示剂缺失——例2

这块胶跑胶时间过长以至于全部的指示剂都跑出凝胶。

由于泳道有些扭曲，这就对相对迁移率的分析造成了困难。

如果凝胶前端的指示剂完整，泳道之间的相对迁移率都可以做比较，哪怕是凝胶扭曲或者同一电泳槽两块凝胶的别离胶高度不一致。

无论别离胶的绝对高度是否一致，相对迁移率对于组成均一的凝胶来说都是一致的。

前端指示剂缺失——例3

从这块胶曲率来看应该是属于由于两侧薄板之间结合稍微松弛形成的边缘效应〔"

皱眉〞效应〕。

由于前端指示剂也是缺失的，因此很难准确分析其相对迁移率。

但是如果有完整的前端指示剂作为参考线，即使存在"

皱眉效应〞也可以进展比较。

病症5——条带仅在凝胶顶部

过早终止电泳——例1

很明显这块胶的指示剂前端位于什么位置。

仍有继续电泳的空间可以把条带分得更开以增加分辨率。

相对迁移率是为了分析凝胶一样位置上一样大小的蛋白。

随着蛋白迁移距离的增加分辨率逐渐增高直到弥散限制了分辨率的继续提高。

过早终止电泳——例2

这两块胶一个是7%的一个是14%的，看起来都还不错。

有些人做实验室很不耐烦过早就终止了电泳。

这些胶虽然可以用，但是如果继续别离直到指示剂到达凝胶底部可能效果会好得多。

这种情况可能发生在你很晚跑电泳的时候，你的教师都饿了，而你却不能让他等你一步一步地做完。

病症6——混杂因素

扭曲的条带

有这个问题的凝胶在整个"

失误大全〞中到处可见。

这是由于别离胶的外表不平所造成的，因此当样品浓缩之后所有的条带都变扭曲的形状。

扭曲的条带也可以见于电场的不均一，但是这种条带的扭曲应该是对称的。

加样孔不成形

当样品溢出至邻近加样孔，你就会观察到横贯几个孔的连续的蛋白条带〔箭头所示〕。

事实上，这种情况通常发生在加样孔深度不够或者样品不慎漏至加样孔外。

此外，我们也很可能用陈旧的上样缓冲液。

使用Cleland试剂〔DTT〕的好处就是它可以减少二硫键的形成但是却没有二巯基乙醇的难闻。

但是二巯基乙醇却要稳定得多。

二硫键将各个单独的多肽链接在一起并在非变性条件下维持一些蛋白的折叠状态。

这可以造成某些蛋白泳动异常。

高密度胶

这块胶明显是非正确聚合的。

聚丙烯酰胺的密度相当高以至于只有少数小分子蛋白可以进入别离胶。

条带也由于上样量过大发生扭曲，事实上大多数凝胶在超过一个合理的浓度范围之后都不能均匀的聚合。

破碎胶

这个结果可能非常令人沮丧。

你做了一个非常好的实验，但是在处理凝胶的时候却发生了破裂。

记住如果你收集了足够多的碎片这块胶仍然是可以用的。

电场效应

在一定程度上来说这个现象是正常的，只是在这里电场被夸大了。

两块挡板在凝胶边缘处干扰了电场，因此这种拉力使得样品的靠近边缘的一端被加强，结果就产生了这种"

皱眉效应〞。

ϑ可能某些条带会出现"

微笑现象〞，但是只要整块胶都有蛋白条带，那么肯定是皱眉的形状。

我猜如果把你浸在蓝色染料中然后拉着你在电场中跑，你也一定会皱眉的

病症7——包含多种病症的失败凝胶

多种病症——例1

许多时候你跑的胶会有多种病症同时存在。

由于评论凝胶的目的就是改善你的实验，因此发现是什么导致这些意料之外的效应非常重要。

接下来你就可以着手改进你的跑胶质量。

这块胶：

缺乏前端指示剂——电泳时间过长；

条带扭曲——别离胶上沿不平，最可能的原因是压胶的液封不恰当；

右侧泳道上样量偏大。

多种病症——例2

出现电场效应，条带弯曲。

上样量太大。

别离胶上沿不平，条带扭曲。

多种病症——例3

上样量不均一〔相邻加样孔上样不同〕，导致某些条带被压缩。

胶上有一些痕迹而且被完全脱色。

这说明可能是由于没有正确取放凝胶——用手直接接触凝胶导致胶外表留下蛋白而被考马斯亮蓝染色。

有时候你可以得到非常漂亮的指纹！

病症7——千奇百怪的胶

例1

装甘氨酸的容器和装氯化胆碱的非常相似。

由于胆碱的吸水性要强于甘氨酸，因此如果错误地用于电极缓冲液肯定会出现一些变化。

胆碱是一种根底的化合物，但是肯定不是甘氨酸的替代物。

这里我们找到了一个这样的实例。

虽然在电泳一段时间后发现后立即更换了缓冲液，但是还是太晚了。

例2

这个图由捷克的T.Sedlacek提供。

跑的时候电流过高导致发热量过大。

例3

这两块胶由E.MoralesRayas提供。

一种可能的解释是可能这两次跑胶时在加样与实际跑胶之间间隔时间太长。

第一块胶中间的几个泳道出现了增宽和压缩交替的形式，而第二块胶的条带那么向凝胶边缘扩散。

当蛋白样品参加上样孔后即开场弥散到积层胶，同时向垂直和两侧发生〔在没有电场的情况下蛋白弥散的方向是随机的，因此上样后必须尽快开场电泳〕。

较小分子量的蛋白弥散速度快于大分子量的蛋白。

如果蛋白横向扩散就会影响邻近泳道的电场，特别是邻近的泳道蛋白含量更高时。

但是如果所有的样品组成相似并序贯上样，弥散造成的影响就不是这么重要。

但是仍然会造成条带的失真。

例4

显然在实验室中用塑料瓶大量储存Tris-甘氨酸电极缓冲工作液并不是好主意。

我们看不见缓冲液中的霉菌，但是它确实存在其中。

注意脱色后这块胶的指示剂下方都呈透明的颜色，而胶的背景却仍然呈蓝色，说明霉菌蛋白在整个电泳过程中已经渗透到凝胶之中。

Example1

"

Smearing〞，导致拖尾效应有很多的原因，最终要的是丙烯酰胺灌制的不够均匀和样品量过大！

这是当时学生制胶时底下已经凝固，然后再重新补上一局部的浓缩胶和别离胶所致！

当然重叠在一起，无法区分也是难免了。

Example2

样品量过大而出现了样品"

穿插〞污染，正常的当载样在20to40micrograms/well将会很漂亮。

Example3

样品量过大，当然胶灌制的也不够均匀。

由于过量的样品影响了个别泳道的电场，使的有些条带宽，有的窄些。

Example4

Smearing〞〔注意泳道4〕，这可能和样品中的含有大量脂类的膜相关蛋白引起的：

由于不连续的胶中，样品被浓缩的很厉害。

所有样的迁移速率在样品过积层胶后都会慢下来，当到达别离胶时，PH的改变使得聚集的膜相关蛋白有沉降的倾向，但另一个方面，电泳过程又不断的溶解这些蛋白，因此便出现了泳道4中连续的黑色托尾，通过WESTERN验证后，这些都是一个组分造成的！

Example5

这张还不是太糟糕。

泳道4还加上飞纹，原因是样品未能处理好，上样量控制的也不够好，另外跑的过程可能电压过大；

另外这张胶当时做的时候，别离胶凝固的并不是很好，蛋白穿过胶孔时，浓度并不均一，因此形成了飞纹而不是一片黑色托尾。

由于样品跑的比较直且齐整，因此电场还是比较均匀的。

泳道5中的蛋白没有很好的溶解。

Example6

简直一塌糊涂！

首先做好别离胶时，没有封闭。

另外，样品很快的沉降到不平整的脚面上，随着电泳的进展，样品不断的融解，以至形成托尾而不是一条条清洗的条带。

另外，这个样品可能含有杂质比较多〔不溶性杂质或基因组DNA〕，可见上样前的充别离心也是必要的!

Example7

条带太淡。

背景脏且不够均匀，说明电泳缓冲液有污染〔杂质在电泳过程中不断的进入胶中〕，或者板子没有洗干净。

在溴芬兰线的后面还有连续的细线，说明上样不够小心，致使样品飞了出孔，同时也污染了其他的相临样品。

Example8

完全是染液重复利用惹的祸，对于这张〔只有下面着色〕，只要重新再染，效果还是可以的。

Example9

这是一张银染的结果。

本来一切都小心奕奕的，结果把胶放到去离子水中回家了，过了一夜，第二天染色结果变成这个样子了，呵呵~~

原因：

固定在胶中的蛋白都溶到水里了。

Example10

电泳停的太早。

如果能继续再跑，效果就好了，当然，缓冲液必须有足够的缓冲能力，否那么会引起扩散。

Example11

这张图大家最主要的看看是胶孔作的不够齐整〔我用箭头标出了〕。

另外，可能由于选用旧的上样缓冲液，致使2-mercaptoethanol挥发，电泳的样品没有完全处于变性状态下，这使得跑出的结果难以很好预测。

Example12

胶的浓度过大〔不是自己的，浪费也不心疼〕，只有少量的小分子蛋白能入胶；

由于胶的浓度过大，聚合不够均匀，载样过大，出现上面的情况自然是必然的了！

Example13

可能由于选用旧的上样缓冲液，复原试剂已经挥发，另外缓冲液中SDS的量也应该稍微的补加〔可能有析出〕，样品根本无法进入胶中。

只有让别离的蛋白入胶，才能进展良好的别离。

Example14

要么样品盐浓度过高，要么别离胶不均匀。

因此应该把局部样品中的盐透洗除去，或者一直采用较小的电流来跑，可能效果会稍微的好一点点。

当然，根本的还是应该去盐份〔如果重复结果一致的话〕。

Example15

做的好图。

【专题讨论】我在SDS-PAGE中所犯的错误

蛋白质电泳配的10×

TBE母液,使用时用1×

TBE时,是不是取一份10×

TBE母液,加9份水啊？

假设用０.5×

TBE，是不是取一份母液加１９份水啊？

　　　实在不好意思，太简单的问题

SDS-PAGE中AP的质量与新旧比较重要，我们一般将其分称于几个EP管中，用时再用ddH2O溶解，一般只用一周左右；

SDS应该不会出现什么问题，放一年左右都没大问题；

电泳缓冲液一般只可用2次，屡次重复使用会出现拖尾带

蛋白质电泳用的缓冲液应是Tris-甘氨酸，TBE是用来电泳核酸的；

10×

一般指的是10倍深度，用时稀释成1倍。

虽然此帖发了快一年了,但我还是和大家分享一下我的经历,希望对后来者有些须帮助:

1.用琼脂糖封胶好象优点奢侈,除了用琼脂粉以外还可以用12.5%的淀粉,煮沸致透明即可.

2,APS配好后可用EP管分装,保存于-20度

3,一般的电泳仪的正负接头都有颜色指示,红色示正极（bio-rad）,有的（大板）红色指示的却是负极.

4,marker点了就好分辨点样顺序,可不用切角,但不点marker时却必须点上.

5,剥胶时可把浓缩胶刮掉,一边用流水冲洗一边剥,这样比较保险.

10%的SDS放在室温或4℃都会出现沉淀,加热一下就可以了.

请教几个问题：

1、我的胶凝后总有少量水分析出，是否正常？

2、按照分子克隆配的12％胶20kDa的蛋白跑不出来，且染料的位置有一条深染的条带，只有15％的胶下面条带才消失，我跑的是细菌总蛋白，是否是因为胶的实际浓度低所致？

3、细菌沉淀直接加2×

buffer，煮沸5分钟变性，离心后上样，是否可行？

为什么有的样品稀，有的样品特浓，上样都困难，跑出来后严重脱尾？

4、哪位高人有蛋白表达方面的经历请指教！

xue_yj163.

答复:

1,正常;

2,12%跑20kD没问题的;

3,细菌沉淀我们是加1倍的buffer,沸水煮8-10min,小离心机12000rmp5-10min;

煮的时候要小心EP管,没盖严或崩开的话样品就会有特浓的情况发生.

4,这里有很多做过蛋白表达的,本人做过三年.

今天做胶,所用凝胶储液,别离胶和浓缩胶BUFFER都是去年11月底的,居然也凝固了,不知这样的胶能否用来电泳"

另外在灌胶时发现别离胶和浓缩胶溶液里都有少量白色絮状沉淀,不知是不是溶液放置太久之故还是本身就有的,因为以前做实验时也发现过类似的现象.

谢谢指点!

最近一直跑同工酶，不知道大家凝胶时是什么温度？

个人认为高温下使凝胶快速聚合比较好，特别是4mm的厚板，根本不用封水，特别平。

常温下自然聚合经常会出现锯齿状的边缘，就是不知道对电泳有没有影响。

感觉没什么差异

琼脂是可以封底的，我们实验室一直在用哦，而且效果很不错。

凝固几分钟就可以了

我也在做SDS-PAGE的电泳,使用的是恒压,请教各位一个问题:

电压大小和别离样品的性质关系怎么样"

大了好还是小了好啊"

琼脂粉可以用的，我就是用这个，其实没什么影响的，2％的琼脂粉凝结的很慢，我每次用4％啦，从没出现过漏胶的问题。

另外SDS我也是常温放着的，TEMED我是常温避光放置，AP4度保存。

丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺不能久置，最好新配。

其它的问题也就是熟练而已啦。

最近我在跑SDS-PAGE时，发现胶上局部条带出现山峰状的高耸，有点象心电图的样子。

第二个问题是：

肉眼看胶的背景很干净，可是用Amersham的

ImageScanner进展凝胶扫描时，调整比照度后却发现有显色比较深的竖条带贯穿在某个样品的蛋白条带上下。

请问各位高手这是什么原因导致的？

以前曾有帖子说这是因为存在不溶性蛋白的缘故，可我的样品全都是可溶性蛋白。

我想把自己的"

问题〞凝胶上传给大家分析，可是我发现可以上传的那个工程好似消失了，所以我不知道该如何让大家看见我的胶。

抱歉，只能口述了。

对于大家上述谈到的问题，我也说说自己的体会。

〔1〕AP我们一般是现用现配，配好后未用完的一般在4度保存一周。

一周后的必丢弃。

〔2〕10%SDS在室温保存一年，感觉也没什么问题。

气温下降时可能会出现白色絮状物，当时碰到这个问题，我是把旧溶液丢弃，重新配制。

后来我们实验室的技师说，加温溶解后应该还可以用。

但本人没试过。

供大家参考。

〔3〕1MTris（pH6.8）和1.5M（pH8.8）我也放在4度保存，理论上说在室温保存即可。

可我们室温保存的Tris曾发现絮状物，我不太清楚什么原因，可能是配置时间太长了？

但我感觉放4度保存效果很好，已经大半年了，没有出现絮状物的情况。

〔4〕TEMED我们是4度避光保存，丙烯酰胺棕色瓶4度保存。

理论上，TEMED是易吸湿的无色液体，吸水那么加速氧化变成黄色，会降低其增速作用，最好不要用。

暂不用者最好密封保存在深冻冰箱中。

但我们4度保存的TEMED通常都是黄色的，感觉用起来也没什么问题。

丙烯酰胺理论上4度可保存一个月，但我们通常都会超过这个时间期限，可能至少也有2、3个月，也没什么问题，但还是建议大家配制溶液时一次少配点，譬如50ml或100ml。

另外我们实验室用的是Amersham的电泳仪，是用凡士林来封底的。

用起来也很方便。

大家有用5*LOADINGBUFFER的吗"

配方就是分子克隆的浓缩一下是吗"

为何我跑的胶老是歪的，用的是国产电泳仪，

经历而已,用1.5%的琼脂糖封胶相当好!

当然,其实各实验室都有自己的一套东西,希望大家多交流。

俺是新的手啦，不懂的很多。

maker可以放在一测，另外我们做完别离胶后用异丁醇封顶，效果挺好的，不妨试一试

我最近跑胶感觉积成胶凝的特别慢，别离胶就没有，为什么啊？

而且我跑的Maker最大的一条带要么看不到，要么变成很细的很近的两条带，是怎么回事呢？

换了一管新的也是一样！

哈，又见面了

胶凝的慢不用说，肯定是试剂的问题，想解决，那就把temed多加2ul，，aps增加10左右，保证快些，另外你的aps建议重赔，此外凝的时候放在37度也会快点。

你的marker其他带怎么样，而且最大的本来就比较浅，出现两条带可能使你跑胶的问题

我也有问题想问一下，为什么跑胶中会出现条带的歪斜，

如果是试剂的问题的话为什么别离胶可以在30分内就可以凝好呢？

我APS是配好后分装，拿了一管新的也是一样啊！

我想我现在跑胶是有点问题，可到底是什么问题我还不知道，在注意一下拉！

问大家一个问题，我最近跑胶时，发现别离胶下边距离边缘1cm的地方经常出现比较大的气泡状的东西，今天更坏的是下边的别离胶竟然裂开了，而我这次配胶是昨天晚上配的，今天早上用，刚开场并没有气泡产生，过了几个钟头之后才开场出现气泡的，而且溴芬兰遇到气泡后就变成了黄色。

我今天加了冷凝水，应该不是温度的事情，请问谁知道该解决这个问题，我已经遇到这个问题不下6，7次了，谢谢！

！

我们曾出现过这种情况，主要因为玻璃板不平或不干净所致，胶凝时会收缩，与玻璃板之间如果结合不严密的话，那就会出现气泡或者裂开了，你只要换一块板或者好好洗洗，就应该没有问题了

我在铬酸中泡过玻璃板，应该挺干净的，至少比我以前的干净，不过，下次再好好洗洗试试。

另外，可能的原因我想是不是ap，我的ap用了好久了，今天我重新配了，到现在为止胶还没裂，因为我现在跑14%的胶，可能ap对他影响比较大。

大概没有比不拆封胶边条更让人郁闷的了，尤其有一次已经跑了近一个小时。

可别忘

1、当然电压大了，胶跑的快，时间短，别离效果差，所以如果要跑胶的样品蛋白的分子量差异不大的话，要用的电压要小，这样别离效果好；

如果分子量差异大的话，就用大电压，可以快速看到结果。

2、菌液样品一般要小电压，因为它的蛋白多，电压大不容易分开

根据我们实验室的经历。

一般使用的是恒流。

压缩胶15mA,别离胶30mA.

还是恒压好，100V，

--------------------------------------------------------------------------------

有个师兄做了块尽一平米的胶，他狂加TEMED与AP，疯狂，不过很有效。

好嘿人哦！

如果有条件，可以用Bio-rad的电泳仪，就不用封了，非常方便。

不过我研究了bio-rad的制胶装置，然后自己做了一个同样的，效果不错哦！

我下面用的是一般的软泡膜