生物分子学复习提纲Word格式.docx

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DNA

RNA

结构

双链分子

单链分子

组成

碱基、戊糖、磷酸

碱基不同

A、G、C、T

A、G、C、U

戊糖不同

脱氧核糖

核糖

碱基互补配对

A=T、G=C

A=U、G=C

分类

细胞核DNA、线粒体DNA

mRNA、tRNA、rRNA

功能

遗传信息的载体、复制和转录的模板

翻译、转运及参与核糖体的构成

基本性质：

DNA溶液黏度远大于RNA溶液。

核酸既含有磷酸基，又含有嘧啶和嘌呤，属两性化合物，一定条件下可使其带电荷，利用这一性质可通过电泳来分离DNA。

1μmDNA=3000bp=2x106Dalton

DNA结构：

DNA的一级结构（primarystructure）特征：

DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序，即碱基的排列顺序。

DNA的二级结构（secondarystructure）特征：

两条反向平行的脱氧核苷酸链绕同一中心轴，右手螺旋。

磷酸-戊糖骨架位于外侧，两条链上的碱基以A=T、G三C相连，构成碱基平面，位于螺旋内侧。

DNA的三级结构（tertiarytructure）特征：

环状DNA及超螺旋。

原核生物：

DNA超螺旋共价封闭环状双螺旋再进一步螺旋。

真核生物：

DNA双螺旋——核小体——串珠状多核小体细丝——螺线管——超螺线管——染色单体

RNA结构：

1.不含T只含U，含有稀有碱基或称修饰碱基。

2.除个别外均为单股多核苷酸链，发夹式结构式是各种RNA二级结构的共同基础和主要组成形式。

3.不仅是单股链，碱基比例不遵守Chargaff法则。

4.在碱性溶液中，易被水解为许多2’,3’-环状单核苷酸，进而水解为2’-核苷酸及3’-核苷酸。

5.加热可使其变性，温度大大低于DNA，增色效应不如DNA。

6.某些情况下可储存遗传信息进行反转录，如病毒。

7.某些RNA兼有DNA和蛋白质（酶）的功能。

四、掌握基因、基因组、基因簇、内含子、外显子等基本概念，熟悉表示基因大小的方法。

基因：

是一个具有遗传功能的DNA片段或碱基序列，存在于染色体特定区域，是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核酸序列，决定这蛋白质的合成。

基因组：

指细胞或生物体的一套完整单个的遗传物质。

一个基因组包括一整套基因。

原核——整个染色体；

二倍体高等生物——维持配子和配子体正常功能的最低数目的一套染色体；

病毒——颗粒内全部基因。

基因簇：

位于同一染色体上彼此相近的一组相同或功能相关的基因的总称

内含子：

是真核生物细胞DNA中的间插序列。

这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。

外显子：

是真核生物基因的一部分，它在剪接（Splicing）后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。

表示基因大小的方法：

1.C值：

存在于单倍体基因组中的DNA量，以碱基对bp或质量pg为单位，为真核生物中每一生物的特征。

2.碱基对数目：

单位bp。

3.分子质量：

分子质量单位u（原子质量），核酸是大分子，质量单位以千原子质量单位Ku或百万原子质量单位Mu表示。

4.质量

5.摩尔数：

1Mu双链DNA=1pmol；

1ug碱基对数为1kb的双链DNA=0.68pmol。

6.光密度：

核酸溶液在260nm波长区有最大吸收峰。

1个单位光吸收度A260相对应为——双链DNA50ug/ml；

单链DNA30ug/ml；

RNA40ug/ml。

五、了解病毒、原核生物和真核生物基因组的主要特点以及核外遗传。

（一）病毒

1.一般特点：

DNA和RNA不共存于同一种病毒颗粒中，有些单链有些双链。

除逆转录外，都为单倍体或单拷贝，某个基因只在病毒颗粒中出现一次。

噬菌体基因是连续的，真核生物病毒基因不连续含有内含子。

DNA病毒一般都比RNA病毒大，生活周期较复杂。

乙肝——DNA病毒。

2.肿瘤病毒：

可以被病毒有效感染的细胞称为允许细胞。

DNA肿瘤病毒的特征是其感染有明显的种属特异性，感染非允许细胞时只有早期基因表达，无病毒颗粒形成，仅有小部分细胞转化为癌细胞。

RNA肿瘤病毒就是逆转录病毒，如HIV。

3.噬菌体：

侵袭细菌的病毒，核酸只有一个分子。

生活周期分为两种类型，一类称为溶菌性，也叫裂解生长；

另一类为溶原性也叫溶原生长。

感染具有特异性，每种只能感染一种细菌中少数几个菌株。

（二）原核生物

1.细菌：

仅有一条环装双链DNA组成，具有三级结构，没有核膜也没有细胞核结构。

1%DNA被甲基化，不受核酸内切酶影响，避免损伤，影响DNA分子构象，影响蛋白质和DNA的互相作用。

2.质粒：

存在于细菌和真核细胞染色体外的小环状DNA分子。

对宿主细胞生存不是必要的，但可补充细菌基因的不足。

按质粒复制机理分为严紧控制型、松弛控制型（基因工程技术应用）。

按功能分为F质粒（性质粒）、R质粒（耐药质粒）、col质粒（产生大肠杆菌素因子，杀死不含大肠杆菌素的亲缘细菌）、降解质粒、致病质粒。

按转移方式分接合、可移动、自传递质粒。

按大小分为大、小质粒。

3.转位因子和耐药基因：

转位因子指可移动的基因成分，是指能够在一个DNA分子内或两个DNA分子之间可以动的DNA片段转位作用最大特征是原来位置上的转位因子荏苒留在原位，二八一个新合成的DNA副本插入到另一个位点上。

（三）真核生物

1.与原核基因的主要区别：

具有细胞核；

每种生物都有一定的染色体数目，除了胚子为单倍体，一般为双倍体；

均是单顺反子，一个基因只产生一个mRNA和一条多肽链，无多顺反子的操纵子。

真核生物存在大量重复DNA顺序。

不编码顺序大于编码顺序。

具有内含子，因此基因不连续。

2.假基因：

真核四分之一基因因剑戟顺序发生突变而失去功能，不能表达或表达异常。

基因之间还可以被一些与内含子性质不同的插入顺序隔开，一般称为间隔DNA。

3.核外遗传：

线粒体、叶绿体、胞内共生体和质粒均是遗传基因载体，与染色体遗传系统不同的独立遗传系统，这一体系称为核外遗传。

*六、掌握复制、转录、翻译的概念。

了解其基本过程。

（一）复制：

以亲代DNA为模板,按碱基互补配对原则,聚合成新的子代DNA链的过程。

半保留复制：

1.氢键断裂；

2.两条链分别为模板按照碱基互补配对方式合成新链。

真核生物DNA复制总速度快于原核生物。

5’→3’模板链上，DNA的新链合成是不连续的，先合成若干片段（冈崎片段），再通过DNA连接酶链接，合成较慢称为滞后链。

（二）转录：

是以DNA的一股为模板合成一条互补RNA的过程。

过程：

1.聚合酶来到转录起点附近。

DNA里隐含转录起点的序列称为启动子。

原核生物的RNA聚合酶可以直接辨认启动子，真核生物的RNA聚合酶则需藉助於转录因子。

2.解开DNA的双螺旋。

负责解开双螺旋的酶是解螺旋酶。

原核生物的RNA聚合酶具有解螺旋酶的功能，但是真核生物的RNA聚合酶没有，其DNA的双螺旋系由特定的转录因子解开。

3.以DNA的一股为模板合成RNA，所用的原料是核苷三磷酸。

4.终止转录。

真核生物和原核生物利用不同的信号终止转录。

（注：

遗传密码的终止密码子代表肽链合成的终止，并非转录的终止）。

启动子（promoter）：

又称启动基因，是DNA模板上专一地与RNA聚合酶结合并决定转录从何处起始的部位，也决定基因的转录效率。

（三）翻译：

以mRNA为模板合成肽链的过程称翻译，61种编码20种氨基酸。

*七、掌握加样缓冲液的基本组成和作用。

了解电泳和离心的基本原理。

（一）加样缓冲液

类型

成分

贮存温度

I

0.25%溴酚蓝、0.25%二甲基苯青FF、40%（w/v）蔗糖水溶液

4℃

II

0.25%溴酚蓝、0.25%二甲基苯青FF、15%聚蔗糖（Ficoll）水溶液

室温

III

0.25%溴酚蓝、0.25%二甲基苯青FF、30%甘油水溶液

IV

0.25%溴酚蓝、40%（w/v）蔗糖水溶液

V

碱性加样缓冲液：

300mMNaOH、6mMEDTA、18%聚蔗糖（Ficoll）水溶液、0.15%溴甲酚绿、0.25%二甲基苯青FF

（二）电泳原理：

带电离子在电场中移动时，受到两种力的作用：

一种是电场力，使带电粒子移动；

一种是移动的粒子受到的阻力，阻止粒子移动。

（三）离心原理：

根据物质大小、形状、密度的差别，即它们在溶液中的沉降系数、浮力密度不同，应用离心力（向心力）使其分离、浓缩、提纯并对之进行分析。

离心力是主要力量，离心力大小取决于离心机速度和离心机转头半径；

沉降系数是指在单位离心力的作用下，物体沉降的速度。

*八、掌握核酸分离的基本原则和主要步骤。

（一）基本原则：

1.保证核酸一级结构的完整；

2.排除其他分子的污染。

包括不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子，其他生物大分子的污染应该降到最低并排除其他核酸分子的污染。

（二）主要步骤：

1.破碎细胞；

2.去除与核酸结合的蛋白质，多糖以及脂类等生物大分子；

3.去除其他不需要的核酸分子；

4.沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂志；

5.核酸纯化。

九、熟悉核酸分离制备的基本方法和原理以及主要试剂的作用。

（一）溶解法：

将破碎后的细胞在苯酚和氯仿异戊醇的混合溶液中轻轻摇晃，以沉淀蛋白质和其他杂物，然后离心以除去。

另外可选用去污剂等去除蛋白质。

最后用以纯将核酸从溶液中沉淀出来。

注意防止核酸酶的存在。

（二）层析法：

羟磷石灰对核酸具有较大亲和力，并在大多数条件下不吸附蛋白和多糖。

（三）电泳法：

主要有琼脂糖凝胶电泳和聚丙酰胺凝胶电泳法。

（四）超速离心法：

常用有蔗糖密度梯度超速离心法和CsCI沉降平衡超速离心法。

（五）核酸的沉淀浓缩发：

最大优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些盐离子与杂志，在一定程度上纯化核酸。

沉淀盐：

NaAc、NH4Ac、LiCl、KAc、MgCl2、含有SDS的用NaCl。

有机沉淀剂：

乙醇、异丙醇、聚乙二醇PEG、精胺。

沉淀条件：

DNA——0℃冰水，10~15min；

RNA——等体积异丙醇置于-20℃，30min。

*十、掌握PCR技术的基本概念和原理，熟悉各种PCR技术的特点和应用。

（一）概念：

聚合酶链反应PCR是一项DNA体外合成放大技术。

（二）原理：

在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应。

⑴预变性：

94℃2~5min

⑵循环30次：

①变性：

94℃30~60sec循环次数取决于扩增效率图；

②退火：

55℃30~60sec退火温度取决于引物的长度和GC含量；

③延伸：

72℃30~60sec延伸时间取决于被扩增片段的长度和DNA聚合酶的扩增效率。

⑶充分延伸：

72℃5min（保证延伸完全）产物于4℃保存，产物检测常用琼脂糖凝胶电泳的方法

（三）各种PCR技术的特点和应用

1.锚定PCR：

是一种单特异引物PCR的方法，用于扩增一侧序列已知，而另一侧序列未知的核酸片段，用于解决未知序列的扩增。

2.不对称PCR：

使用两种不同浓度的引物进行PCR，生成单链DNA用于测序。

3.反向PCR：

对一个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。

选择一直序列内部没有切蒂安的限制酶对此DNA进行酶切，链接形成环装DNA分子，此时选择合适方向的与已知序列两末端互补的引物，经PCR后可得到未知序列的DNA片段。

4.多重PCR：

在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。

多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或检测缺失设置内对照。

用于检测特定基因序列的存在或缺失。

5.原位PCR：

原位聚合酶链式反应（InStillPCR，Is－PCR）是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。

直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。

可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。

6.逆转录PCR/RT-PCR：

是一种将RNA逆转录合成cDNA与PCR结合起来，分析基因表达的一种快速灵敏的方法，其原理是以RNA为模板，依照RNA中核苷酸序列，以dNTPs为原料，在逆转录酶的催化下合成互补DNA（cDNA），再以cDNA为模板，PCR扩增两段引物之间的目的基因，常用于研究真核生物可表达基因。

、

7.差别PCR：

将靶基因和一个单拷贝的参照基因置于同一PCR系统中进行扩增；

凝胶电泳分离后呈两条带，比较其丰度就可以定量测出靶基因的拷贝数。

8.实时/荧光定量PCR：

通过引入荧光标记分子，对PCR过程中每一个循环产物荧光信号进行实时监测，计算PCR产物的量，从而实现对起始模板的定量分析。

9.PCR技术的应用：

①遗传性疾病的基因诊断②传染病监测③癌基因检测④法医学上应用⑤分子生物学其他应用。

十一、熟悉末端终止法测序和化学裂解法测序的基本原理和过程。

（一）Sanger双脱氧链末端终止法的测序

原理：

利用高保真DNA聚合酶I，以单链DNA为模板，以含标记的dNTP为底物，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸ddNTP为链反应终止剂，根据碱基互补配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序列梯度的互补DNA链，后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。

步骤：

1.将待测DNA制备成单链分子，以此作为DNA聚合酶的模板。

2.将人工合成的寡聚核苷酸与模板中待测区域的3’-部位退货，作为聚合酶反应的引物。

3.以含有标记的dNTP为底物分置四个反应管中。

4.得到的核酸标记的单链DNA分子，经加热变性和测序凝胶电泳分离，再次放射自显影得到图谱直接读出DNA序列。

（二）化学裂解法

首先对待测DNA片段进行单侧末端的放射性核素标记。

标记后的DNA片段分成4~5个反应体系，分别用不同的化学试剂处理，使DNA片段分别于某一种或某一类碱基处断裂，并且控制化学反应进行的程度，使得平均每个DNA分子只在1个位置被裂解，而断裂的位置随即发生在DNA片段某种碱基中的任何一个。

最后连同其它反应体系的产物在变性聚丙酰胺凝胶上相邻的加样孔中进行电泳分离，放射自显影后得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列。

1.DNA样品的制备；

2.待测DNA样品的末端标记；

3.单末端标记DNA片段的纯化；

4.碱基特异性化学降解反应；

5.序列胶高压电泳分离；

6.读取序列

*十二、掌握遗传（DNA）多态性的定义、标准，掌握RFLP技术和RAPD技术的概念，并熟悉其原理。

定义：

不同个体之间，其生化特征、抗原特性都存在着由遗传造成的变异，形成一系列的多态性，称为遗传多态性。

标准：

发生遗传分离的基因座位具有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为具有多态性。

PFLP技术：

通过核酸的限制性酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同，因而称为限制性酶切片段长度多态性技术。

RAPD技术：

随机扩增多态性，随机序列的9~10个核苷酸引物，对基因组的DNA进行PCR扩增，再电泳分离。

*十三、熟悉核酸分子杂交的概念、基本原理和主要步骤。

核酸分子杂交技术：

是用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列（形成异源双螺旋），再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置或大小显示出来的技术。

探针：

是指能与特定核酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核苷酸链。

探针标记的常用方法有放射性标记、半抗原标记、酶标记等。

Southernblotting：

以DNA/RNA为探针，检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子的过程/方法，用于基因组作图、测定基因的拷贝数。

Northernblotting：

以DNA为探针，检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子的过程/方法，用于RNA的相对分子质量、丰度和基因表达研究。

Westernblotting：

以抗体作探针来检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的抗原蛋白质分子的过程/方法，用于特异蛋白质的检测与半定量分析、蛋白质分子之间的相互作用研究。

检测对象

液相杂交

大小分子蛋白、核酸

原位杂交

DNA、RNA

固相杂交

点杂交/狭缝杂交

菌落杂交

细菌

Northern杂交

RNA、mRNA

Southern杂交

1、酶切图谱分析2、特定基因定性和定量3、基因突变分析4、限制性片段长度多态性的分析

反点向杂交

检测扩增产物中是否含有目标基因

基因芯片技术

十四、熟悉Sourthern和Northern印迹及其基本过程，熟悉探针的种类和来源，了解其标记方法。

（一）Southernblotting的基本步骤

①酶切已纯化的待测DNA探针设计

②凝胶电泳分离、变性制备探针

③转移至固体支持物标记探针毛细管转移法、电转移法、真空转移法

④预杂交封闭非特异位点纯化探针

⑤探针与同源DNA片段杂交

⑥漂洗去除非特异结合探针

⑦检测及结果分析

（二）Nouthernblotting的基本步骤

①提取待测DNA探针设计

②凝胶电泳分离、变性制备探针

③转移至固体支持物标记探针

④预杂交封闭非特异位点纯化探针

⑤探针与RNA片段杂交

⑥检测与结果分析

（三）探针

（1）探针（probe）：

是一小段用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。

<

1>

DNA探针：

是最常用的核酸探针，长度在几百bp以上的双链或单链cDNA片段（通常400—500bp）

2>

RNA探针：

放射性或非放射性标记的RNA分子，用于探测与之互补的DNA或RNA链，RNA探针通常通过克隆相应DNA在体外转录合成而制备（通常400—500bp）

3>

寡核苷酸探针：

一般有17-50个核苷酸组成，可以是寡聚脱氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸

（2）探针的特点：

高度灵敏性；

不影响碱基配对的特异性；

不影响探针分子的主要理化性质；

4>

对酶促反应活性无影响或影响不大；

5>

检测方法具有高度灵敏性和高度特异性。

*十五、掌握基因工程的概念、基本原理和主要过程。

熟悉各种工具酶，特别是限制性内切酶的使用。

基因工程：

通过体外基因重组和载体的作用，是新构建的遗传物质组合进入到新个体中，并在此新个体中稳定地遗传和表达的过程。

基本原理：

获取目的基因后，利用工具酶把载体DNA与外源DNA链接，利用载体把DNA重组体导入宿主细胞，以改变生物原有的遗传特性。

主要过程：

1.通过酶切消化或PCR扩增，获得目的基因片段；

2.体外将目的的基因片段连接到能自我复制并具有选择性标记的载体分子上，形成重组DNA；

3.将重组DNA引入到寄主细胞内；

4.将大量的细胞繁殖群体中筛选获得重组DNA分子的寄主细胞克隆；

5.进行外源基因的表达和产物的纯化。

限制性内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、碱性磷酸酶等。

限制性内切酶：

是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。

（具有识别自身和异源DNA的功能，通过切割破坏异源DNA来保护自身而自己固有的DNA则有修饰酶的保护而免受降解破坏）

DNA重组技术中的工具酶及其作用：

限制酶——识别和切割双链DNA分子特异序列

DNA连接酶——连接切割后的目的基因和载体的互补末端

Klenow片段——补平双链DNA片段的3’末端

Taq-DNA聚合酶——不依赖模板，在扩增产物3’末端加APCR扩增目的DNA片段，用于T-A克隆

末端转移酶——在DNA片段3’末端加上同聚物尾，用于标记探针的3’末端或人工构建黏性末端

碱性磷酸酶——催化切除多聚核苷酸的5’磷酸基团，防止载体自连

*十六、掌握基因诊断的概念及其特点，了解基因诊断的主要方法和应用。

基因诊断：

利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对人体状态和疾病做出诊断的方法。

“基因”诊断的方法：

DNA：

核酸分子杂交（Southernblotting、斑点杂交、菌落杂交、原位杂交）、

PCR（DNAPCR、PCR-SSCP、多重PCR、原位PCR）、RFLP、限制酶酶切图谱分析、DNA测序差异显示-逆转录-PCR/DD-RT-PCR：

将RT-PCR和测序凝胶电泳结合起来，对不同类型、不同分化时期细胞的基因和基因表达情况进行比较，以获得对整个细胞生命过程进行分析的有用信息。

RFLP：

由于基因的突变导致某一限制性内切酶的酶切位点序列产生（或消失），酶切后经电泳分离出大小不同的片段，包括点多态性和序列多态性，用于检测点突变、突变的纯合子和杂合子。

DNA单链构象多态/PCR-SSCP：

将PCR产物双链DNA变性为单链DNA，加样于非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间构象有关，而空间构象又与单链DNA序列有关。

因此，电泳后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。

多重PCR：

是指在一次PCR反应中加入多对引物，同时扩增DNA链上不同序列片段的一种PCR技术，主要用于分析一些超大基因的大片段缺失。

等位基因特异寡核苷酸序列（ASO）探针杂交：

将受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交，可用于明确诊断突变的纯合子和杂合子。

*十七、掌握基