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通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.
4、几个概念:
(1)扩增曲线:
(2)荧光阈值:
(3)Ct值:
CT值的重现性:
5、定量原理:
理想的PCR反应:
X=X0*2n
非理想的PCR反应:
X=X0(1+Ex)n
n:
扩增反应的循环次数
X:
第n次循环后的产物量
X0:
初始模板量
Ex:
扩增效率
5、标准曲线
6、绝对定量
1)确定未知样品的C(t)值
2)通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记:
二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍
方法一:
SYBRGreen法
(一)工作原理
1、SYBRGreen
能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBRGreen
只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时,DNA双链分开,无荧光
4、复性和延伸时,形成双链DNA,SYBRGreen发荧光,在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化:
1、SYBRGreen使用浓度:
太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测
2、Primer:
引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准
3、MgCl2的浓度:
可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
4、反应Buffer体系的优化
5、反应温度和时间参数:
由酶和引物决定
6、其他与常规PCR相同
(二)应用范围
1、起始模板的测定;
2、基因型的分析;
3、融解曲线分析:
可以优化PCR反应的条件,对常规PCR有指导意义,如对primer的评价;
可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
(三)优点及缺点
优点:
对DNA模板没有选择性;
适用于任何DNA;
使用方便;
不必设计复杂探针;
非常灵敏;
便宜。
缺点:
容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性;
但可以通过融解曲线的分析,优化反应条件;
对引物特异性要求较高。
方法二:
TaqMan---水解型杂交探针
**5′端标记有报告基团(Reporter,R)
,如FAM、VIC等
**3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)
**探针完整,R所发射的荧光能量被Q基团吸收,无荧光,R与Q分开,发荧光
**Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针
注意:
每扩增一条DNA分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光
PCR反应的建立:
1、引物、探针的设计:
探针Tm为68-70℃,<
30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素,
引物尽量靠近探针,扩增片段<
400bp,引物Tm为59-60℃
2、反应参数的确定:
一般为:
94℃,10-20S
60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高)
也可通过温度梯度优化退火温度72℃,45S,
3、优化引物和探针浓度:
获得最小Ct值,信号/背景比值的最大值
引物浓度:
50-900nM
探针浓度:
50-250nM
4、其他与常规PCR相同
(二)优缺点
对目标序列的高特异性
------阴性结果确定
设计相对简单
------与目标序列某一区域互补
重复性比较好
只适合一个特定的目标;
委托公司标记,价格较高;
不易找到本底低的探针
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