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生物操作机理及其分离机理
单元操作
分离机理
分离对象举例
膜分离微滤
超滤
反渗透
透析
电渗析
渗透气化
压力差、筛分
浓度差、筛分
电荷、筛分
汽液相平衡、筛分
菌体、细胞
蛋白质、多糖、抗生素
糖、氨基酸
盐、蛋白质
氨基酸、有机酸
乙醇
萃取有机溶剂萃取
双水相
液膜萃取
反胶团萃取
超临界萃取
液液相平衡
相平衡
有机酸、抗生素
蛋白质、抗生素
氨基酸、有机酸、抗生素
氨基酸、蛋白质
香料、脂质
层析凝胶过滤层析
反相层析
离子交换层析
亲和层析
疏水相互作用
层析聚焦
分配平衡
电荷、浓度差
生物亲和作用
疏水作用
脱盐、分子分级
甾醇、维生素、肽
蛋白质、氨基酸、抗生素、核酸、有机酸
蛋白质、核酸
蛋白质
电泳凝胶电泳
等电点电泳
等速电泳
区带电泳
筛分、电荷
筛分、电荷、浓度差
蛋白质、氨基酸
离心离心过滤
离心沉降
超离心
离心力、筛分
离心力
菌体、菌体碎片
蛋白质、核酸、糖类
四、发酵工业下游技术的一般工艺过程
下游加工过程由各种化工单元操作组成。
由于生物产品品种多,性质各异,故用到的单元操作很多,其中如蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作,理论比较成熟,而另一些则为新近发展起来的单元操作,如细胞破碎、膜过程和色层分离等,缺乏完整的理论,介于两者之间的有离子交换过程等。
1,一般工艺过程
一般说来,下游加工过程可分为4个阶段:
培养液(发酵液)的预处理和固液分离;
初步纯化(提取);
高度纯化(精制);
成品加工。
2,工艺过程的划分:
发酵的下游加工过程可以下过程:
(1)预处理和固液分离:
目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。
(2)初步分离:
目的是除去与产物性质差异较大的杂质,为后道精制工序创造有利条件。
(3)高度纯化:
去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。
(4)成品制作:
成品形式由产品的最终用途决定。
3,选择下游加工工艺的原则:
(1)是胞内产物还是胞外产物
(2)原料中产物和主要杂质浓度
(3)产物和主要杂质的物理化学特性及差异
(4)产品用途和质量标准
(5)产品的市场价格
(6)废液的处理方法等
第二节发酵液的预处理和固液分离
发酵液预处理和固液分离的目的:
分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物);
除去部分可溶性杂质和改变滤液性质,以利于提取和精制的顺利进行。
一、发酵液的预处理
采用理化方法设法增大虚浮液中固体粒子的大小、或降低粘度,以利于过滤。
去除会影响后续提取的高价无机离子。
(一)预处理的方法
①高价无机离子的去除方法;
②杂蛋白质的去除;
③发酵液的凝聚和絮凝。
1,高价无机离子的去除方法
(1)钙离子,可用草酸。
草酸溶解度较小,故用量大时,可用其可溶性盐,如草酸钠。
反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固,提高滤液(也称为原液)质量。
但草酸价格较贵,应注意回收。
如四环类抗生素废液中,加入硫酸铅,在60℃下反应生成草酸铅。
后者在90~95℃下用硫酸分解,经过滤、冷却、结晶后可以回收草酸。
(2)镁离子,可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物,用磷酸盐处理,也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。
此法可用于环丝氨酸的提取。
(3)铁离子,可加入黄血盐,使形成普鲁士蓝沉淀。
2,杂蛋白质的去除方法
(1)热变性
(2)沉淀
(3)大幅度改变pH
3,发酵液的凝聚和絮凝
凝聚和絮凝的概念,过去常常混淆,现已趋于明确区分开来。
凝聚是在中性盐作用下,由于双电层排斥电位的降低,而使胶体体系不稳定的现象。
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下,基于架桥作用,使胶粒形成粗大的絮凝团的过程,是一种以物理的集合为主的过程。
(1)机理
电解质将胶体粒子表面上的电荷中和,减少存在于胶体粒子间的静电斥力,使伦敦·
范德华(London—Vanderwaals)吸引力占优势,这样胶体就会凝聚成较大、较密实的粒子,或在某些高分子絮凝剂存在下,基于架桥作用,使胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。
(2)方法
在稀溶液中加入电解质以促进凝聚和絮凝。
试剂包括酸、碱、简单电解质和合成的高分子电解质。
(3)常用的絮凝剂
聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚胺衍生物、氯化钙、磷酸氢二钠
(4)影响絮凝的因素
虽然絮凝的机理目前还不十分清楚,但是已知道絮凝效果与絮凝剂的加量、分子量和类型,溶液的pH,搅拌速度和时间等因素有关。
在絮凝过程中,常需加入一定的助凝剂以增加絮凝效果。
料液中,絮凝剂浓度增加有助于架桥充分,但是过多的加量反而会引起吸附饱和,在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象。
如淀粉酶发酵液的絮凝试验中,絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响如下图所示。
适宜的加量通常由实验得出,虽然高分子絮凝剂分子量提高,链增长,可使架桥效果明显,但是,分子量不能超过一定的限度,因为随分子量提高,高分子絮凝剂的水溶性降低,因此分子量的选择应适当
溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度,从而影响分子链的伸展形态。
电离度增大,由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用,而使分子链从卷曲状态变为伸展状态,所以架桥能力提高。
例如,采用碱式氯化铝和阴离子聚丙烯酰胺搭配使用的混凝方法处理2709碱性蛋白酶发酵液,发酵液pH对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响如下图所示。
可见pH适当提高能增大滤速,这是因为聚丙烯酰胺分子链上的羧基解离程度提高,而使其达到较大的伸展程度,发挥了最佳的架桥能力。
絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高,还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质,如菌体、细胞和细胞碎片等,提高了滤液质量
二、发酵液的过滤
微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。
过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。
在过滤操作中,要求滤速快,滤液澄清并且有高的收率。
1,影响过滤速度的因素
过滤速度和以下因素有关
①菌种;
②发酵条件(培养基的组成、未用完培养基的数量、消沫油、发酵周期、)。
(1)菌种对过滤速度影响
真菌的菌丝比较粗大,如青霉菌的菌丝直径可达10ì
m,发酵液容易过滤,不需特殊处理。
其滤渣呈紧密饼状物,很容易从滤布上刮下来,故可采用鼓式真空过滤机过滤。
放线菌发酵液菌丝细而分枝,交织成网络状。
如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0ì
m左右,还含有很多多糖类物质,粘性强,过滤较困难,一般需经预处理,以凝固蛋白质等胶体。
细菌发酵液的菌体更细小,因此,过滤十分因准,如不用絮凝等方法预处理发酵液,往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。
(2)培养基的组成对过滤速度影响
用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难;
发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。
(3)发酵周期对过滤的影响
正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。
在菌体丝自溶前必须放罐,因为细胞自治后的分解产物一股很难过滤。
有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高,但严重影响发酵液质量,使色素和胶状杂质增多、过滤困难,最终造成成品质量降低。
2,改善过滤性能的方法
发酵工业中用于改善发酵液过滤性能的方法通常有:
等电点、蛋白质变性、吸附、凝聚和絮凝、加入助滤剂、直接在发酵液中形成填充-凝固剂、酶解作用。
(1)过滤助剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒,它能使滤饼疏松,滤速增大。
过滤助剂可解决两个问题
①滤饼的可压缩性问题
②小粒子如菌丝碎片和细菌细胞,会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。
使得预覆盖层的部分孔被堵塞,影响了渗透性。
加入助滤剂可以解决这一问题
常用的过滤助剂有:
硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉
助滤剂的加入有两种方法:
①在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm),该方法,会使滤速降低,但滤液透明度
②直接加入发酵液中(助滤剂的用量,有一条经验规则可供参考,即助滤剂用量若等于悬浮液中固体含量时,滤速最快。
)。
(2)填充-凝固剂
改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂,它们能相互作用,或和某些溶解性盐类发生反应生成不溶解的沉淀(CaSO4,AlPO4等)。
生成的沉淀能防止菌丝体粘结,使菌丝具有块状结构,沉淀本身即可作为助滤剂,并且还能使胶状物和悬浮物凝固,如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠,生成的磷酸钙可作为填充-凝固剂。
一方面作为助滤剂,另一方面还可使某些蛋白质凝固。
又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理,生成的磷酸钙沉淀,能使悬浮物凝固。
多余的磷酸根离子,还能除去钙、镁离子。
并且在发酵液中不会引入其它阳离子而影环环丝氨酸的离子交换吸附。
正确选择反应剂和反应条件,能使过滤速度提高3~10倍。
(3)酶解作用
如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好用酶将它转化为单糖,以提高过滤速度。
例如万古霉素用淀粉作培养基,加入淀粉酶后,能使过滤速度加快。
3,固-液分离设备的选择
不同性状约发酵液应选择不同的固-液分离设备。
常用于发酵液的分离设备有:
板框压滤机、鼓式真空过滤机、离心沉降分离机
(1)板框压滤机
板框压滤机的过滤面积大,过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整,并能耐受较高的压力差,故对不同过滤特性的发酵液适应性强,同时还具有结构简单,价格低,动力消耗少等优点,因此,目前,国内广泛被采用。
但是,这种设备不能连续操作,设备笨重,劳动强度大,卫生条件差,非生产的辅助时间长(包括卸框、卸饼、洗滤饼,洗滤布,重新压紧板框等),阻碍了过滤效率的提高。
自动板框过滤机是一种较新型的压滤设备,它使板框的拆装,滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等操作都能自动进行,大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。
对于菌体较细小,粘度较大的发酵液,可加入助滤剂或采用絮凝等方法预处理后进行压滤。
对于难过滤的枯草杆菌发酵液,可设计一种特别薄的板框以减小滤饼的阻力。
另外,也可采用带有橡皮隔膜的压滤机,过滤结束时,在滤板和橡皮膜之间通入压缩空气来压榨滤饼,将液体挤压出来。
其优缺点概括如下:
优点:
①板框压滤机的过滤面积大;
②过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整,并能耐受较高的压力差;
③结构简单,价格低;
④动力消耗少等优点。
缺点
①不能连续操作,设备笨重,劳动强度大;
②卫生条件差;
③非生产的辅助时间长,阻碍了过滤效率的提高。
(2)鼓式真空过滤机
鼓式真空过滤机能连续操作,并能实现自动化控制,但是压差较小,主要适用于霉菌发酵液的过滤。
例如,过滤青霉素发酵液的速度可达800L/(m2.h)。
而对菌体较细或粘稠的发酵液不太适用。
一种较好的解决办法是过滤前在转鼓面上预铺一层助滤剂,操作时,用一把缓慢向鼓面移动的刮刀将滤饼连同极薄的一层助滤剂一起刮去,这样使过滤面积不断更新,以维持正常的过滤速度。
放线菌发酵液可采用这种方式过滤。
①能连续操作;
②能实现自动化控制
缺点:
压差较小,主要适用于霉菌发酵液的过滤。
(3)离心分离
①优点:
②分离速度快,效率高;
③操作时卫生条件好等优点;
④适合于大规模的分离过程。
①投资费用高,;
②能耗较大。
三、微生物细胞的破碎
微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外,例如细菌产生的碱性蛋白酶,霉菌产生的糖化酶等,称为胞外产物。
还有许多是存在于细胞内,例如青霉素酰化酶,碱性磷酸酯酶等,称为胞内产物。
对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤,获得澄清的滤液,作为进一步纯化的出发原液,对于胞内产物,则需首先收集菌体进行细胞破碎,使代谢产物转入液相中,然后,再进行细胞碎片的分离。
1,微生物细胞的破碎技术
常见的细胞破碎方法有:
机械方法(球磨机、高压匀浆器、X-press法、超声波破碎)和非机械方法(酶解法、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法)
(1)球磨机
研磨是常用的一种方法,它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨,使达到细胞的某种程度破碎。
这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高,通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。
(2)高压匀浆器
采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法,利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀,由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂
各种菌体一次通过高压匀浆器的破碎率
菌体
压力(Mpa)
破碎率(%)
面包酵母
啤酒酵母
大肠杆菌
解肢假丝酵母
53
55
62
61
67
43
(3)X-press法
一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25˚C至-30˚C形成冰晶体,利用500MPa以上的高压冲击,冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。
细胞破碎是由于冰晶体的磨损,包埋在冰中的微生物的变形所引起的。
该法的优点是适用的范围广,破碎率高,细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高,该法对冷冻—融解敏感的生化物质不适用。
(4)超声波法
细胞的破碎是由于超声波的空穴作用,从而产生一个极为强烈的冲击波压力,由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力,促使细胞内液体发生流动,从而使细胞破碎。
对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同,杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎,对酵母菌的效果级差。
该法不适于大规模操作,因为放大后,要输入很高的能量来提供必要的冷却,这是困难的。
(5)酶解法
利用酶反应,分解破坏细胞壁上特殊的键,从而达到破壁的目的。
专一性强,发生酶解的条件温和。
酶水解费用较贵,一般只适用于小规模的实验室研究。
溶菌酶是应用最多的酶,它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的α-1,4糖苷键,使脂多糖解离,经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。
(6)自溶作用
是酶解的另一种方法,所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。
影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。
自溶法在一定程度上能用于工业规模,但是,对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性,自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。
(7)渗透压冲击
是较温和的一种破碎方法,将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),入达到平衡后,介质被突然稀释,或者将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,水迅速进入细胞内,引起细胞壁的破裂。
渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌,或者细胞壁预先用酶处理,或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。
(8)冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化,反复多次而达到破壁作用。
由于冷冻,一方面能使细胞膜的硫水键结构破裂,从而增加了细胞的亲水性能,另一方面胞内水结晶,使细胞内外溶液浓度变化,引起细胞突然膨胀而破裂。
对于细胞壁较脆弱的菌体,可采用此法。
但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。
另外,还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。
(9)干燥法
可采用空气干燥,真空干燥,喷雾干燥和冷冻干燥等。
空气干燥主要适用于酵母菌。
真空干燥适用于细菌的干燥。
冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。
干燥法条件变化较剧烈,容易引起蛋白质或其它组织变性。
(10)化学法
用酸碱及表面活性剂处理,可以使蛋白质水解,细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。
某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法,如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。
但是,这些试剂容易引起生化物质破坏,还会带来分离和回收化学物质的问题。
2,破碎方法的选择
选择合适的破碎方法需要考虑下列因素:
(1)细胞的数量;
(2)所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性;
(3)要达到的破碎程度及破碎所必要的速度,
(4)尽可能采用最温和的方法;
(5)具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术。
第三节沉淀法
沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法。
由于其浓缩作用常大于纯化作用,因而沉淀法通常作为初步分离的一种方法,用于从去除了菌体或细胞碎片的发酵液中沉淀出生物物质,然后再利用色层分离等方法进一步提高其纯度。
沉淀法由于成本低、收率高(不会使蛋白质等大分子失活)、浓缩倍数高和操作简单等优点,是下游加工过程中应用广泛的值得注意的方法。
根据所加入的沉淀剂的不同,沉淀法可以分为:
盐析法;
等电点沉淀法;
有机溶剂沉淀法;
非离子型聚合物沉淀法;
聚电解质沉淀法;
高价金属离子沉淀法。
一、盐析法
1,盐析的定义
在蛋白质溶液中加入中性盐使其沉淀析出的过程。
2,机理
通过破坏蛋白质分子表面水膜或中和蛋白质分子表面水膜使蛋白质凝聚沉淀。
3,盐析法的优点
成本低,不需要什么特别昂贵的设备;
操作简单,安全;
对许多生物活性物质具有稳定作用。
4,盐析法的缺点
沉淀物中含有大量的盐析剂。
5,盐析用中性盐的选择
(1)
常用的中性盐
常用的中性盐有MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4。
(2)
选择中性盐应注意的问题
使酶沉淀完全、收率高;
且有利于酶的提纯,而本身又易去除。
对酶无毒性,应用不受影响。
价格低廉。
废水处理容易。
6,盐析剂用量的确定
通常采用实验的方法确定。
7,盐浓度的表示法
盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示,饱和的溶液成为100%饱和度。
8,蛋白质的浓度与盐析的关系
利用盐析方法分步分离蛋白质各组份和溶液中蛋白质实际浓度有很大关系。
LogC1=â
-KsI1
这里的I1是蛋白质开始沉淀时的离子强度。
但如果这种蛋白质在溶液中含量较低(设其浓度为C2),则需要加人较多的中性盐,蛋白质才开始沉淀。
(设此时离子强度为I2)应写作:
LogC2=β-KsI22
Log(C1/C2)=Ks(I2-I1)
9,离子强度和类型对盐析的影响
几种蛋白质析出时所需硫酸铵的离子的强度
在低离子强度下,许多蛋白质比在纯水中的溶解度大大增加,但当溶液中离子强度不断增加时,各离子之间及离子与溶质分子之间相互竞争水分子,结果导致溶质的溶解度渐渐减少,产生盐析现象。
一般来说离子强度越大,蛋白质的溶解度越低。
但蛋白质的盐析现象比一般有机分子复杂一些,蛋白质分子大,而且有许多表面电荷,这些表面所带电荷常随着周围离子和溶剂分子排列秩序的影响而不断变化着,蛋白质分子内还有许多相互作用的基团,这都造成了许多经典理论不能十分完美地解释蛋白质盐析的原因。
几种蛋白质在不同离子强度下的盐析效应见上图,从图中可以看出,当硫酸按饱和度达到20%时,纤维蛋白原首先析出,饱和度增至28—33%时,血红蛋白析出,饱和度再增至33—35%时,拟球蛋白析出,饱和度至50%以上,清蛋白析出,饱和度最后达到80%时,肌红蛋白析出。
可见不同蛋白质发生盐析时所需求的离子强度是不同的。
所以用不同离子强度分步盐析的方法,就可以分离混合物中各种组份。
在进行分离的时候,一般从低离子强度到高离子强度,顺次进行。
每一组份被盐析出来后。
经过固—液分离(冰冻离心或过滤),再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度,使另一种蛋白质组份盐析出来。
离子强度的大小对蛋白质的溶解度起着决定性的影响。
但在同样的离子强度下,离子种类的不同对蛋白质溶解度的影响也不同。
下图所示是几种不同电解质下,一氧化碳血红蛋白溶解度曲线。
图中不同离子种类对蛋白质溶解度的影响,可以从Hofmeister系列理论中获得解释:
即离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强,离子半径大而低电荷的离子的影响较弱。
单价盐如KCl,NaCl的盐析效果一般比较差。
蛋白质在不同电解质中的盐析效应
从图可知不同盐类对同一蛋白质的盐所效应具有不同的“Ks”值,Ks值可由各种益的盐析曲线的斜率表示。
它们的减少顺序是:
磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
按照Hofmeister系列,镁离子比铵离子小,但实际上硫酸铵的盐析效应比硫酸镁好,主要是镁离子在同离子强度下产生了一层颇大的离子雾,从而减少了它的盐析效应。
10,pH对盐析的影响
一般地说,蛋白质所带净电荷越多,它的溶解度越大;
如果所带的电荷减少至接近于零时溶解度最少,我们称此时的pH值为该蛋白质的等电点(PI)。
改变pH或特异地加入与蛋白质极性基团结合的离子(叫反离子)即可改变蛋白质的带电性质,也就是改变了蛋白质的溶解度。
下图是在不同pH的浓磷酸盐缓冲液下血红蛋白的溶解度曲线。
从图中曲线可见,蛋白质在不同的pH下有着不同的溶解度,远离等电点处蛋白质的溶解度最大,等电点处溶解度最小。
因此在盐析时常选择溶液pH值在该蛋白质等电点附近。
但必须注意在水中或稀盐溶液中测得的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的。
需根据实际情况调整pH值至蛋白质溶解度最低处,才能使盐析获得更好效果。
11,温度对盐析的影响
温度是影响溶解度的重要因素,对于许多无机盐和小分子的有机化合物,温度升高,溶解度也相应增大。
但对于蛋白质、酶等生物大分子在高离子强度溶液中,温度的升高,它们的溶解度有时不但不升高。
反而减少。
许多蛋白质在高离子强度溶液中25C时的溶解度比4C时溶解度明显地减少。
如图3—5所示。
但必须指出这种温度升高溶解度的下降现象只有在高离子强度下才能发生。
在低离子强度或纯水中,蛋白质溶解度大多数在一定范围内是随着温度增加而增加的。
在一般情况下,蛋白质的盐析温度要求不严格,可以在室温下进行,只有某些对温度比较敏感的酶,要求在低温0-4C下操作。
以避免活
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