石蜡包埋组织的DNA提取及其应用Word格式文档下载.docx

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7．-70℃放置2～4h

8．9000×

g离心1h

9．沉淀物用70%乙醇洗1次

10．干燥，TE（pH7.2）溶解。

表18-6TE9DNA提取液的制备

500mmol/L

Tris

20mmol/L

EDTA

10mmoo/L

NaCl

1%

SDS

500μg/ml

蛋白酶K

PH8.0

5μm组织切片

↓

常规脱蜡、水化

第一次溶液A孵育（去上清）

第二次溶液A孵育（留上清）

氯仿-异戊醇抽提

RNA酶和蛋白酶消化

酚抽提

沉淀

（却除未螺旋化DNA）↓

透析

图18-6　石蜡包埋组织DNA提取流程（Drbeau等，1986）

溶液A

2×

SSC

100μg蛋白酶K/ml

1%SDS

　　不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。

Southern印迹杂交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb），因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。

故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。

与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。

PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Sle－bos,etal,1990；

Smit,etal.1988）、蛋白酶消化法（Impraimetal.1987；

Brice,etal.1989）。

这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h，DNA即可释放出来。

此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且重复性不好。

这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对TaqDNA多聚酶的抑制所致。

　　二、影响DNA提取质量的因素

　　1．固定剂对DNA的影响固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。

目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。

Warford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：

①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化；

②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。

DNA提取过程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。

　　bramwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。

Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量明显降低。

Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）处理标本不能获得完整的DNA。

　　乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。

Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。

每mm3乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本（19.4μg/mm3）。

经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性卫星带，说明DNA被完成消化。

Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。

　　Sato等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好无损。

其基本方法为：

将组织放至4℃丙酮浸透，移至-20℃过夜。

然而再用丙酮分别在4℃和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2～3h，石蜡包埋。

结果显示，每10mgAMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±

14.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4±

13.76μg）。

酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。

提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。

　　2．固定时间对DNA的影响固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。

这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。

如果事实果真如此，那么固定的时间是一个重要的变异因素。

然而，Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。

Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。

该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。

固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。

Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30%，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。

根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110之内。

　　3．固定温度等其他因素对DNA的影响核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节　，其中温度效应显得特别重要。

室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸；

加热到65℃时，氢键开始断裂；

约90℃时，产生两条单链分子。

在此变性状态下，甲醛与酸反应很快，通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。

　　最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。

通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。

　　酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。

一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构的改变。

当pH达到2.5以下时，几乎所有的碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；

随后出现N-糖苷键水解，使嘌呤残基游离；

最后，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。

上述改变亦受温度或离子强度的影响。

加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。

然而，即使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。

福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。

　　4．组织处理过程对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之间，主要分布于100～1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>

20kb。

这除与固定剂、固定时间等因素有关外，可能的原因还有：

①组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。

当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；

②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；

③蜡块贮存的时间长短不一。

虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的DNA大小无绝对区别，但新近的蜡块比贮存10年以上的标本所获得的DNA分子量大。

可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。

　　组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA变性，而产生单链DNA片段。

单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。

　　三、提高DNA提取质量的方法

　　1．蜡块的选择从福尔马林固定的组织标本中未能提出完整的高分子量DNA的重要原因之一，是应用了固定不充分的组织。

因此，在DNA提取前应检查组织切片。

如果有自溶、退变或组织结构不清，大片出血等改变的蜡块不能用；

若有明显坏死存在的蜡块，最好不用或将坏死部分切去后再用。

尽可能地选用新近标本，缓冲福尔马林、丙酮和乙醇固定者最佳。

　　2．DNA提取方法学的改善为了提高石蜡包埋组织DNA提取的质量和效益，人们从不同方面进行了探索。

其中在DNA提取液的改良，蛋白酶的消化时间和DNA纯化等问题上取得了进展。

①DNA提取液主要含SDS和蛋白酶K的TE缓冲液。

固定和包埋组织由于化学修饰作用，使得DAN与蛋白质不易分离。

因此，必须增加SDS和蛋白酶K的浓度和作用时间：

SDS可增至1%～2%，蛋白酶K200～500μg/ml，最高可达1mg/ml；

作用时间一般为2～4天，最长可达7天。

蛋白酶K可分次加入，并注意不时震摇，使酶与组织充分接触。

Koshiba等发现，利用Goelz等和Dubeau等提出的DNA提取方法，不能够得到令人满意的完整DNA。

尿素和胍（guanidine）是DNA自然和人工交联最有力的剥脱剂，2-巯基乙醇可干扰二硫键，促进蛋白变性。

作者对DNA提取液进行了改良，加入高浓度（4mol/L）尿素和2-巯基乙醇。

应用此缓冲液，有效地从包埋组织中获得高质量DNA。

②DNA释放率对于不同的组织类型是有差异的，取决于组织细胞密度和细胞外间质的多少。

对于细胞丰富、含有很少间质的组织（例如脾脏），通过24h孵育80%以上DNA可释放出来；

相同量的DNA释放对于富含致密间质的子宫肌瘤则需要6天时间；

转移性畸胎瘤含中等细胞密度和疏松的间质，DNA释放率亦为中等。

由此可见，对不同类型的组织DNA提取，蛋白酶K的孵育时间可作适当调整，以求最大量地获取大分子DNA。

此外，对于Dubeau等提出的DNA提取过程中分次消化步骤的必要性，也有人提出异议。

因为低、中分子量的核酸存在对限制性内切酶的消化和杂交不起作用。

③Dubeau等发现，不适于进行酶切反应和杂交研究的化学修饰的DNA，可通过搅起完整的DNA而被动除去，因而强调了螺旋化（spooling）在DNA纯化中的重要性。

该作者还发现延长组织固定时间的影响之一就是减少了可螺旋化DNA的量，杂交分析显示，螺旋化DNA杂交信号强，而未螺旋化DNA信号减弱。

因此，增加DNA螺旋化可提高提取DNA质量和杂交效率。

但是，Moerkert等认为未螺旋化DNA不影响进行点杂交分析。

　　3．避免DNA机械性损伤福尔马林固定和石蜡包埋使组织变得坚韧，很难达到匀浆的效果。

经常的做法是将组织切成3～5μm薄片，使每一细胞都被切开。

但是，我们认为切片太薄，容易过多地将DNA切断，影响高分子量DNA的获得率。

最好是采用15～20μm的厚切片。

高浓度蛋白酶K消化2～4天，使能达到细胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。

并尽可能避免机械性匀浆过程造成的DNA剪切。

　　此外，在NDA释放出来以后的提取过程中，应尽可能轻柔操作，避免过多地移管。

若必需移管时应选用大口吸管。

尽可能避免人为的DNA剪切。

纯化DNA用TE（pH8.0）溶解放4℃保存即可，若短期不用时应-20℃冻存，但切忌反复冻融，以免DNA降解。

　　四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学

　　由于DNA提取方法的改善和DNA质量的提高，几乎所有基因分析的技术均可用于石蜡包埋组织，但目前分子病理学研究的常用方法是点杂交、Southern印迹杂交和多聚酶链反应（PCR）。

　　1．点杂交　　鉴于包埋组织DNA有一定程度的降解，因而点杂交被认为是一种简便、快速和实用的方法，特别适用于较大样本的筛选。

Dyall–smith等（1988）采用未经抽提的蛋白酶消化产物直接点膜，进行点杂交分析，在3周内对200多病例进行筛选，对阳性病例和很难解释的弱阳性斑点，再进行原位杂交等方法作进一步证实。

　　2．Southern印迹杂交Southern印迹杂交是经典的基因分析技术，已被广泛地用于基因突变，扩增、重排和丢失等许多方面的研究。

石蜡包埋组织的Southern印迹杂交分析有以下几个方面值得注意：

（1）当所分析的酶切片段长为300～500bp时，包埋组织DNA杂交信号强度只有相同量标准DNA的10%～85%。

信号强度与原始DNA大小呈正相关，最小片段DNA产生最弱的信号。

（2）包埋组织DNA所致的非特异性背景杂交比标准DNA为明显。

这种背景杂交的产生可能是由于不包含到分析基因中两个限制性内切酶识别位点的小片段DNA存在。

　　（3）由于背景杂交明显使得信号模糊，信/噪比缩小。

根据Goelz的经验，约有25%石蜡包埋组织不适于作Southern印迹杂交。

　　（4）某些限制性酶切片段的电泳速度比标准DNA稍迟缓。

可能的原因是DNA直接或间接的化学改变使某些限制性酶切位点失活和/或单链DNA存在。

　　（5）由于小片段DNA的存在，故用作杂交分析的DNA量应适当增加，以增强杂交信号。

　　3．PCR分析PCR技术是近年来分子生物学技术的典范，已被广泛地用于分子病理学的各个领域。

此技术不但特异性好和敏感性高，而且简便、快速、模板DNA要求不高，特别适于石蜡包埋DNA的分析。

　　用于PCR扩增的DNA提取比较简单，既使少量DNA样品亦能产生大量特异性DNA拷贝。

已被成功地用于各代木乃伊DNA的分析，小至1mm2的HE染色切片提取的DNA亦可获得满意的扩增，并可用于诊断。

但是，为了提高PCR的敏感性和可重复性，模板DNA应尽可能地纯化，除去提取物中某些抑制PCR反应的成份。

　　此外，切片过程中要注意防止污染，以免出现假阳性。

　　最近，Davis等（1993）对PCR产物进行单链构型多态性（SSCP）分析，可以提高PCR敏感性5倍以上。

SSCP分析是应用单链DNA在非变性聚丙酰胺凝胶上电泳，根据序列的不同所产生的构型差异来分析PCr产物。

此分析能检测出小到一个碱基的差异，因而可被广泛地用于研究点突变和基因多态性。

　　此外，在包埋组织的DNA提取中往往发现有RNA的存在。

这些未加任何保护而免受降解的RNA，不可能是完整的序列。

然而，此发现提示用福尔马林固定的组织亦可作为Northern印迹杂交分析的可能材料来源。

　　五、分子病理学研究中的应用

　　1．基因重排分析与淋巴瘤的诊断分子生物学技术在肿瘤诊断中的应用，目前仅限于淋巴瘤/白血病。

淋巴瘤以具有特异性抗原受体基因重排的单一性细胞增殖为特征。

因此，克隆性免疫球蛋白（Ig）和T-细胞受体（TCR）基因重排的检出可作为淋巴瘤诊断的重要指标，这在国外许多实验室已成为常规诊断技术。

　　Southern印迹杂交和PCR都已被成功地用于基因重排分析。

此技术在下列病变的诊断和鉴别诊断中特别有意义：

①恶性淋巴瘤与反应性淋巴组织增生的鉴别。

后者为多克隆性细胞增生，不能检出或扩增出克隆性基因重排序列；

②T和B细胞性肿瘤的区分：

PCRβ基因重排支持T细胞源性，而Ig重链基因则为B细胞源性。

然而，一部分病例显示Ig和TCR基因双重排。

在这种情况下，要结合其他基因分析。

若同时伴有Ig轻链（K或人）基因重排则支持B细胞肿瘤；

同时伴有TCRr或TCRs基因重排则为T细胞肿瘤。

另外，也可结合免疫分型。

双基因重排的肿瘤往往一种基因为不完全重排、不伴有相应的抗原受体表达，故免疫表型上往往是单一的。

③T细胞性淋巴瘤的诊断，T细胞肿瘤形态变化多端、免疫表型上无克隆性标记，故对此类淋巴瘤均有必要进行基因分型。

④T细胞优势性B细胞淋巴瘤。

这种肿瘤在形态和免疫表型上很难建立诊断。

⑤残留病变监测和复发的早期诊断。

此技术还可用于识别骨髓的累及、治疗或骨髓移植后残余病变的检测，以及形态学上不能察觉的早期复发的诊断。

<

/P<

p>

某些淋巴瘤/白血病所伴有的特异性染色体易位是另一种类型的基因重排标记。

例如滤泡型淋巴瘤中常出现的t（14：

18）易位，Burkitt氏淋巴瘤的t（8：

14）、t（8：

2）和t（8：

22）易位，以及慢粒或急淋白血病中常见的t（9：

33）易位。

因上述基因重排在淋巴瘤中出现频率不高，故诊断应用价值不大。

　　2．癌基因与抗癌基因的研究分子生物学在肿瘤病理学中另一热点是癌基因和抗癌基因的研究。

自从1981年Weinberg等首先报道人癌基因分离成功以来，至今已有50多种癌基因被发现，这些基因普遍存在于各种生物细胞中，对于细胞的生长和分化起着重要作用。

在正常情况下，其表达受到严格调控；

病理状态下，癌基因活化，表达失控，使细胞原有的正常生物学性状发生改变，从而导致细胞癌变。

据报道，癌基因的结构和功能改变见于造血系统、乳腺、粘膜鳞状上皮、前列腺、肺、肾、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神经系统和软组织等肿瘤。

　　另一类基因称抗癌基因或抑癌基因，现已发现的有p53、Rb、DCC、WT1和NF1等。

其蛋白产物的功能是阻滞癌基因所编码多肽的活性。

因此，如果抗癌基因发生突变或功能丧失，异常的癌基因产物表达失控，而诱发细胞转化为肿瘤。

此现象为见于视网膜母细胞瘤、子宫内膜、结肠、食管等各部位的肿瘤。

　　目前，对人类肿瘤中癌基因和抗癌基因的检测，已经在肿瘤的分类、发病机理、肿瘤生物学行为和预后的关系等方面与肿瘤临床密切结合起来，并正在逐渐地应用于肿瘤的诊断、鉴别诊断和治疗。

（1）癌变机理的研究：

癌基因活化和抗癌基因失活在人类肿瘤的发生发展过程中起重要作用。

已有大量证据表明，至少需要两种以上的癌基因活化的协同作用才能使正常细胞发生恶性转化。

目前研究发现绝大多数肿瘤有一种以上的癌基因过度表达，一种癌基因对靶细胞的永生化起重要作用，而另一种则促进细胞的永生化。

（2）肿瘤生物学待业和预后的研究：

某些癌基因突变及其产物的过度表达与癌细胞的分化和恶性程度有关。

目前研究最多的是c–erbB–2与乳腺癌的关系。

许良中等（1992）发现，浸润性导管癌中c–erbB–2阳性表达率达67%以上，单纯癌阳性率为26.5%，而全部乳癌良性病变皆阴性。

我们的研究发现，c–erbB–2过度表达的乳腺癌预后不良，Schimmelpenning等（1992）也报告伴有c–erbB–2扩增的导管内癌易于发生周围浸润。

此外，rasP21在乳腺癌中的表达也有上述趋势。

　　（3）辅助诊断和鉴别诊断：

bc1-2基因已被用于滤泡型淋巴瘤与反应性滤泡增生的鉴别诊断，前者阳性表达率在80%以上，而后者几乎为阴性；

ras癌基因突变或过度表达有助于甲状腺乳头状癌、乳腺导管癌、结肠腺癌等肿瘤的诊断；

小细胞肺癌常伴有n–myc突变。

　　（4）癌细胞的组织发生：

paget氏病可分乳腺外（EPD）和乳腺内（MPD）两种。

有关paget细胞的起源问题仍有争议。

许良中（1993）观察了c–erbB–2和p53在77例EPD和10例MPD中的表达，认为MPD中的paget细胞是来源于腺癌细胞而不是表皮的角质层细胞。

EPP中的paget细胞也来源于腺癌细胞，但这种腺癌细胞与MPD中的腺癌细胞不同，因为两者基因表达不同。

　　3．遗传病的基因诊断遗传病的回顾性家族调查，可通过石蜡包埋组织完成。

Mueller等描述1例怀疑囊性纤维化（CF）的死婴，石蜡包埋组织是唯一的材料来源。

应用CF基因标记引物，对患儿和其父母的DNA分别进行PCR扩增。

扩增产物用相应内切酶消化并检测限制性片段多态性。

结果显示父母和患儿在同一位点上有意义，表明患儿遗传有突变型CF基因，最后证实了CF的诊断。

　　另一种常见的遗传病–肌营养不良症（DMD），是由Dystrophin基因的DNA序列畸变引起。

Forstboefel等用该基因的已知编码DNA序列，从一死婴尸检组织中得到的DNA进行选择性PCR扩增。

结果发现DMD基因的一关键部分缺失，进而证实了DMD的诊断。

同样可通过亲代DNA分析，区分遗传性或散发性缺失。

　　4．病理微生物的检测核酸杂交和PCR技术对病原微生物的检测亦具有独到之处，除其特异性和敏感性极高外，还可适用于石蜡切片等多种材料，且可避免因培养造成的病原扩散。

特别是一些原位杂交和PCR诊断性试剂盒的问世，使此项检测更加简便易行。

因此，分子生物学将是传染病实验室诊断技术的发展方向。

这方面的应用已有很多报道，本节　不再赘述。

　　5．组织来源的鉴定PCR可用于选择性扩增一部分HLa–DQa基因，这部分是人类基因组中高度多肽性的位点。

DNA序列微小的个体差异，可被特异性cDNA探针区分。

此基因在人群中的正常变异是有图谱的，故可将其用作“基因指纹”来验证组织来源。

在日常工作中偶尔遇到标本的标记错误，当观察组织切片，发现与临床资料不匹配时才被发现。

Shibata等通过分析石蜡标本DNA中HLa–DQa位点解决了这一难题。

另一高度多肽性的基因-低密度脂蛋白受体基因，亦可同样用于标本的鉴定。

　　Dubeau等发现提取DNA的甲基化类型是恒定的，包埋组织仍保留其原有的特异性甲基化特征，籍此可有助于识别某些肿瘤的起源组织。

综上所述，石蜡包埋组织DNA的提取扩展了分子生物学技术在临床上的应用范围。

虽然现在回顾性DNA分析仅用于确定少数特异性诊断，但随着越来越多的感染性病原基因、特异性肿瘤基因和遗传病基因的识别和克隆，相信不远的将来基因诊断的应用范围会进一步拓宽，分子杂交等基因分析技术将会在病理学诊断和研究中发挥越来越重要的作用。

PCR是一种模拟天然DNA复制过程，在体外将特异性目的DNA片段序列进行高效扩增的分子生物学新技术。

自八十年代由美国Muilis发明这项技术以来，由于具有快速、敏感、特异及高效的特点，得以迅速推广，并从这一分子生物

学基本技术扩展