基于发酵产氢的玉米秸秆酶解条件响应面优化Word下载.docx
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中图分类号:
S216.2;
TQ920.6文献标识码:
A文章编号:
0439-8114(2014)07-1645-04
OptimizingEnzymaticHydrolysisConditionsofCornstalkforHydrogenFermentationbyResponseSurfaceMethodology
PANChun-mei1,LILing-chuan2,WANGJing1
(1.BiotechnologyDepartment,HenanUniversityofAnimalHusbandryEconomy,Zhengzhou450046,China;
2.State-ownedAssetsManagementDeptment,ZhongzhouUniversity,Zhengzhou450044,China)
Abstract:
Thecellulosichydrogenproductionfromcellulasehydrolysiscornstalkwasstudiedusingresponsesurfacemethodology(RSM).Theparametersofprocessforenzymatichydrolysisofcornstalkwereoptimizedbyathreefactor-fivelevelcentralcompositedesign.Theresultsshowedthattheoptimalparametersofenzymatichydrolysisofsubstrateweretemperature51.8℃,pH4.84and9.00FPU/gTSofenzymeloading.Themaximumhydrogenyieldfromcornstalkbyanaerobicmixedmicroflorawas208.1ml/gTVSundertheoptimalcondition.Thehydrogenwasattributedtothebioconversionofthegeneratedsolublesugarsfromtheacid-enzymatichydrolysisofcornstalk.Thehydrogen-producingmicroflorahastheabilitytodirectlydegradecellulosetoproducehydrogen.
Keywords:
cornstalk;
enzymaticpretreatment;
cellulosic;
hydrogen;
responsesurfacemethodology
日益严峻的环境和能源问题使开发新型可再生清洁能源迫在眉睫[1]。
我国秸秆等纤维素类生物质资源极为丰富,这些生物质资源大多数被废弃滞留在环境中或被焚烧,利用效率低。
如将这些纤维素类资源通过发酵转化为清洁的氢气能源,对于废弃资源再生、清洁能源生产和生态环境保护具有重要意义。
玉米秸秆等纤维质原料具有高度致密性的结构[2],将其直接转化为能源是相当困难的,原料的高效水解是制约生物能源工业化的主要瓶颈。
纤维素类物质的水解可采用物理、化学或生物的方法,目前多种水解方法已应用于纤维素氢气的生产中,如Nguyen等[3]利用离子液处理方法提高了微晶纤维素的氢气产量,Li等[4]以ClostridiumbutyricumAS1.209为生产菌种,采用汽爆方式处理秸秆后发酵产氢;
Zhang等[5]将玉米秸秆酸解后,产氢量可提高至149.69mL/gTVS,与未处理玉米秸秆相比产氢量提高了将近46倍。
在众多的水解方法中,纤维素酶水解方法具有反应条件温和、不生成有毒降解产物、糖得率高和设备投资低等优点,但是目前在生物制氢领域鲜有酶解秸秆产氢的相关报道。
通过对温度、pH等酶解关键参数的优化可提高纤维素类生物质的水解效率,进而增加纤维素氢气的产量。
响应面法能用较少的试验数据推算出目标值的优化条件,效率高,在微生物发酵方面已有广泛应用[4,5]。
本研究以响应面法优化秸秆的纤维素酶水解秸秆的条件以获得最高的氢气产量,并探讨了玉米秸秆降解产氢的机理,以期为玉米秸秆产氢的应用提供参考。
1材料与方法
1.1供试材料
产氢菌源为牛粪堆肥,取自郑州市奶牛场。
玉米秸秆产自郑州市郊。
纤维素酶由宁夏和氏璧生物技术有限公司提供,纤维素酶酶活力为20FPU/mL。
1.2秸秆水解方法
将粉碎至40目的风干玉米秸秆,用1.5%H2SO4浸泡,固液比1∶10(m∶V,下同),121℃酸水解1h,冷却后用NaOH调整pH为7.0,然后过滤,在得到的玉米秸秆固体残渣中加入纤维素酶,用0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液浸泡,固液比1∶20,水解48h。
玉米秸秆酸酶两步水解得到的所有水解物合并保存在 -20℃,用于进一步的分析和发酵产氢。
分别取原料秸秆(RC)、稀酸处理秸秆(AC)、稀酸-纤维素酶处理秸秆(AEC)和稀酸-纤维素酶处理秸秆产氢后秸秆残渣(AECH)进行成分分析,其中所加稀酸为1.5%H2SO4,利用VanSoest法测定各处理纤维素、半纤维素、木质素的含量[6]。
1.3发酵产氢
将牛粪堆肥用适量水浸泡,煮沸15min后,过滤取上清液。
在上清液中加入5g/L蔗糖和5mL/L营养液,36℃厌氧预培养16h作为产氢种子液;
将1g秸秆的水解物、2mL营养液和15mL预培养产氢种子液装入140mL批式反应器中,用稀酸或稀碱溶液调节至初始pH为7.0,用N2吹扫剩余空间的氧气,用医用橡胶塞密封,(36±
1)℃恒温震荡。
定时检测产气量,分析气相产物中氢气含量。
1.4分析方法
采用3,5二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖含量,生物气中氢气含量用气相色谱法测定[1]。
按一定时间间隔用排饱和食盐水法排出发酵瓶内气体,测量气体体积。
累积产氢量按下述公式计算:
V=V0?
酌i+■Vi?
酌i
其中,V为累积产氢量(mL);
V0为反应器液面上空的体积(mL);
Vi为第i次抽出气体的体积(mL);
?
酌i为第i次抽出气体中氢气含量。
在本研究中根据秸秆的总挥发性固体TVS(Totalvolatilesolid)将产氢量Ps定义为mL/gTVS。
1.5响应面试验设计
采用中心组合试验设计对玉米秸秆酶解条件进行3因素5水平的响应面分析试验,以获得玉米秸秆产氢的最佳酶解条件。
以酶解温度(X1)、pH(X2)、酶用量(X3)为自变量,通过下列公式分别进行编码转换:
x1=(X1-50)/5
x2=(X2-4.8)/0.4
x3=(X3-8)/3
响应面试验设计见表1。
响应面优化回归分析模型为Y=β0+∑βixi+∑βiixi2+∑βijxixj,其中β0、βi、βii和βij分别是截距及回归系数,xi、xj是编码转换后的自变量,响应值Y为氢气产量。
响应值和自变量之间的关系利用Minitab14.1.1软件进行拟合统计分析。
2结果与分析
2.1响应面法对玉米秸秆酶解条件的优化
中心组合试验设计中,不同酶解条件下玉米秸秆的产氢量如表2所示。
利用Minitab14.1.1软件对玉米秸秆的氢气产量进行二次多项回归拟合和数据分析,建立最佳玉米秸秆酶解条件的二次响应面回归模型。
由表3可知,拟合的三元二次方程为:
Y1=205.643+7.562x1+1.9x2+4.425x3-11.92x12-8.957x22-8.607x32-1.875x1x2+3.025x1x3+2.075x2x3
其中,x1、x2和x3分别代表酶解温度、pH、酶用量的编码水平,Y1代表氢气产量预测值。
对回归系数进行检验(表3),结果表明除了酶解温度和pH的交互作用x1x2氢气产量不显著外,其他变量均显著。
酶解温度x1、pHx2、酶用量x3、酶解温度的二次项x12、pH的二次项x22和酶用量的二次项x32对氢气产量Y1有极显著影响。
这说明酶解温度、pH和酶用量是玉米秸秆酶解的重要控制因素。
对回归方程进行方差分析(表4),方程的F值为114.85,相应的概率值P<
0.001,模型决定系数R2=0.993,表明该模型回归显著。
说明回归方程对试验结果拟合较好,预测值和实测值之间具有高度的相关性,可以应用于酶解玉米秸秆氢气产量的理论预测。
为了求得最佳酶解条件以获得最高氢气产量,对所得的回归拟和方程各自的变量求一阶偏导数,并令其为0,得到三元一次方程组。
求解此方程组可以得出模型的极值点:
x1=0.3508,x2=0.1078,x3=0.3317,即当酶解温度为51.8℃,pH4.84、酶用量9.00FPU/gTS时,理论最大氢气产量Ps为207.8mL/gTVS。
根据获得的回归方程,利用Minitab14.1.1软件绘制出经不同酶解处理的玉米秸秆产氢气的响应面分析图和等高线图(图1)。
每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用,此时第三个变量保持在最佳水平。
在酶解温度和pH对玉米秸秆氢气产量的影响中,酶用量固定为9.00FPU/gTS。
由图1A可知,酶解温度和pH对玉米秸秆的酶解效率有明显影响,当酶解温度由40℃升至51.8℃、pH由4.0提高至4.84时,氢气产量急剧增加。
当进一步提高温度和pH,氢气产量呈下降趋势。
在合适的酶解温度下,玉米秸秆水解效率提高,秸秆中的纤维素能大量被转化为可溶性糖,导致氢气产量的增加。
在酶解温度和酶用量对玉米秸秆氢气产量的影响中,pH固定为4.84。
由图1B可以看出,酶用量对玉米秸秆氢气产量的影响也较为明显。
当酶用量和酶解温度分别由2.00FPU/gTS和40℃提高至9.00FPU/gTS和51.8℃时,氢气产量达到最大值,之后随着酶用量和酶解温度的继续增加,氢气产量反而有所下降。
当酶用量过高时产生的高浓度水解产物会对酶系统的催化活性产生抑制作用。
由图1B二维等高线图可以看出,等高线椭圆的主轴倾斜角很小,说明酶解温度对氢气产量的作用要远远高于酶用量对氢气产量的作用。
在pH和酶用量对玉米秸秆氢气产量的影响中,酶解温度固定为51.8℃。
随着pH和酶用量增加至酶解最佳值pH4.84、酶用量9.00FPU/gTS时,氢气产量逐渐增加至最高值207.8mL/gTVS,随后pH和酶用量继续增加,氢气产量则呈减少的趋势。
在二维等高线图中,当等高线为拉长的连续的对角椭圆形时,说明两个因素之间有较为显著的交互作用[7]。
由图1可以看出酶解的3个因素的等高线图都呈椭圆形,其交互作用均显著。
为检验模型的准确性和有效性,在预测的最佳酶解条件下,对玉米秸秆进行5个平行的酶解处理试验,然后利用玉米秸秆水解产物发酵生产氢气。
摇瓶培养试验测得的氢气产量为(208.1±
5.8)mL/gTVS(n=5),试验值与理论预测值非常接近,可见该模型能较好地预测酶解处理后玉米秸秆的氢气发酵情况。
2.2降解过程中玉米秸秆成分的变化
稀酸水解、酶水解等多种水解方式都可将玉米秸秆中的纤维素和半纤维素降解为小分子可溶性糖类。
表5为原料秸秆(RC)、稀酸处理秸秆(AC)、稀酸-纤维素酶处理秸秆(AEC)和稀酸-纤维素酶处理秸秆产氢后秸秆残渣(AECH)的成分分析。
由表5可以看出,利用稀酸高温水解玉米秸秆时,秸秆的降解率为41.9%,半纤维素含量由30.9%急剧下降至1.5%,纤维素降解量较低。
样品中纤维素和半纤维素含量是以酸处理后秸秆固体残渣为基准计算的,由于绝大多数半纤维素被降解,所以纤维素含量会相对增加。
经过纤维素酶水解处理后,秸秆的降解率进一步提高至67.8%,其中纤维素含量由59.6%降至38.6%。
在玉米秸秆产氢过程中,秸秆中的纤维素进一步被混合产氢菌降解产氢,秸秆的降解率升至73.5%,纤维素含量由38.6%降至32.8%。
这也证明了牛粪堆肥混合产氢菌具有直接降解纤维素产氢的能力。
3小结
本研究利用响应面法优化玉米秸秆酶解条件,在酶解温度51.8℃,pH4.84、酶用量9.00FPU/gTS的条件下,氢气产量达到208.1mL/gTVS。
玉米秸秆经稀酸水解和纤维素酶水解后纤维素和半纤维素被降解,天然产氢微生物主要利用其产生的可溶性糖发酵产氢。
另外,天然产氢微生物也具有直接降解纤维素发酵产氢的能力。
参考文献:
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