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A．显微注射技术　农杆菌转化法

B．基因枪法　花粉管通道法

C．农杆菌转化法　显微注射技术

D．基因枪法　显微注射技术

玉米是单子叶植物，对单子叶植物来说，常用的方法是基因枪法；

对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射技术。

4．检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因的常用方法是（　　）

A．DNA分子杂交技术B．荧光分子标记技术

C．放射性同位素标记技术D．显微注射技术

检测目的基因常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等进行标记，以此作为探针，并使探针与基因组DNA杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中。

A

5．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。

下列操作与实验目的不符的是（　　）

A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒

B．用含基因C的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将基因C导入细胞

C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞

D．用分子杂交方法检测基因C是否整合到菊花染色体上

本题主要考查基因工程的相关知识。

由于基因C两端及质粒上均存在限制酶EcoRⅠ的酶切位点，因此，可采用限制酶EcoRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒；

用含基因C的农杆菌侵染菊花愈伤组织（即农杆菌转化法），可以将基因C导入细胞；

由于质粒上存在潮霉素抗性基因（标记基因），因此，可以在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，C项与实验目的不符，选C；

可用分子杂交方法检测基因C是否整合到菊花染色体上。

C

6．（2016·

海南卷）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：

（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即________和从________中分离。

（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是_______________________________________

_______________________________________________________

_____________________________________________________。

（3）在基因表达载体中，启动子是________聚合酶识别并结合的部位。

若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是________。

（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有________和________颗粒。

本题主要考查目的基因的获取方法、基因表达载体的构建方法、目的基因导入植物细胞的方法。

（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，既可在核苷酸序列已知的情况下人工合成，也可用限制酶对生物材料的DNA切割，再选取。

（2）cDNA文库是由mRNA反转录获得的，其中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。

（3）在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。

若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是大肠杆菌。

（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。

（1）人工合成　生物材料

（2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因

（3）RNA　大肠杆菌（或细菌）

（4）金粉　钨粉

A级　基础巩固

1．下列不属于获取目的基因的方法是（　　）

A．利用DNA连接酶复制目的基因

B．反转录法

C．从基因文库中获取目的基因

D．利用PCR技术扩增目的基因

对目的基因（DNA片段）进行复制需利用DNA聚合酶而不是DNA连接酶。

2．下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是（　　）

A．需要限制酶和DNA连接酶

B．必须在细胞内进行

C．抗生素抗性基因可作为标记基因

D．启动子位于目的基因的首端

基因表达载体的构建是指目的基因与载体结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将互补的末端连接起来；

基因表达载体的构建是在细胞外进行的；

基因表达载体包括启动子（位于基因首端使转录开始）、终止子、目的基因和标记基因。

3．水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中由三种氨基酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记。

在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（　　）

A．促使目的基因导入受体细胞中

B．促使目的基因在受体细胞中复制

C．促使目的基因容易被检测出来

D．检测目的基因是否成功表达

标记基因表达的荧光蛋白使目的基因容易被检测出来。

4．基因工程的正确操作步骤是（　　）

①目的基因与运载体相结合　②将目的基因导入受体细胞　③检测目的基因的表达　④提取目的基因

A．③④②①　　　　B．②④①③

C．④①②③D．③④①②

基因工程的基本操作步骤主要包括四步：

（1）目的基因的获取，即④提取目的基因。

（2）基因表达载体的构建，即①使目的基因与运载体结合。

（3）将目的基因导入受体细胞，即②。

（4）目的基因的检测与表达，即③检测目的基因的表达。

5．某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内，来表达产生生长激素。

已知质粒中存在两个抗性基因：

A是抗链霉素基因，B是抗氨苄青霉素基因，且目的基因要插入到基因B中，而大肠杆菌不带有任何抗性基因。

下列叙述正确的是（　　）

A．导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒

B．RNA聚合酶是构建该重组质粒必需的工具酶

C．可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒

D．在含氨苄青霉素培养基中不能生长，但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌

导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒，也可能为普通质粒，A项错误；

构建基因表达载体过程中需要限制酶和DNA连接酶，不需要RNA聚合酶，B项错误；

由于目的基因要插入到基因B中，即抗氨苄青霉素基因破坏，即工程菌不能抗氨苄青霉素，因此不能用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒，C项错误；

据分析可知，在含氨苄青霉素培养基中不能生长，但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌，D项正确。

B级　能力训练

6．科学家通过基因工程，成功培育出能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉，其过程大致如图。

（1）基因工程的核心是__________________________________。

（2）上述过程中，将目的基因导入棉花细胞内使用了________法，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的________中，然后用该农杆菌感染植株细胞，通过DNA重组将目的基因插入植株细胞的________上。

（3）目的基因在棉株体内能否成功转录，分子水平上可采用________方法检测。

（4）如果把该基因导入叶绿体DNA中，将来产生的卵细胞中________（填“一定”或“不一定”）含有抗虫基因。

（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。

（2）将目的基因导入棉花细胞内使用了农杆菌转化法，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的TDNA中，然后用该农杆菌感染植株细胞，通过DNA重组将目的基因插入植株细胞的染色体上。

（3）目的基因在棉株体内能否成功转录，从分子水平上检测可采用分子杂交法。

（4）由于在产生配子的过程中，细胞质基因是随机分配的，因此产生的配子中不一定含有抗虫基因。

（1）基因表达载体的构建

（2）农杆菌转化　TDNA　染色体

（3）分子杂交　（4）不一定

[B级　能力训练]

7．如图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞。

下列说法不正确的是（　　）

A．X是能合成胰岛素的细菌细胞

B．质粒通常有多个标记基因和多个限制酶切点

C．基因与运载体的重组只需要DNA连接酶

D．该细菌的性状被定向改造

X是含有胰岛素基因的细菌细胞分裂形成的，含有胰岛素基因，因此能合成胰岛素，A项正确；

质粒通常有多个标记基因和多个限制酶切点，这样便于目的基因的插入和筛选含有重组DNA的细胞，B项正确；

基因与运载体的重组除了需要DNA连接酶，还需要限制酶，C项错误；

基因工程能定向改造生物的性状，该细菌是采用基因工程技术培育形成的，因此其性状已被定向改造，D项正确。

8．在基因工程操作技术中，为保证目的基因更好地导入受体细胞，有时需要用Ca2＋处理。

下列有关叙述，正确的是（　　）

A．显微注射法中要用Ca2＋处理动物受精卵

B．花粉管通道法中要用Ca2＋处理植物体细胞

C．农杆菌转化法中要用Ca2＋处理植物细胞

D．农杆菌转化法中要用Ca2＋处理农杆菌细胞

用Ca2＋处理原核细胞，会增大细胞壁的通透性，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，即感受态。

在农杆菌转化法中，需要把构建好的重组载体（重组Ti质粒）先导入原核细胞——农杆菌细胞中，此时需要用Ca2＋处理，然后再把含重组Ti质粒的农杆菌导入植物细胞。

9．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（　　）

A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得

B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点

C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来

D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用

本题考查基因工程相关知识。

A项，胰岛素基因只在胰岛B细胞中表达，人肝细胞无胰岛素mRNA，故错误。

B项，复制原点是基因表达载体复制的起点，而胰岛素基因表达的起点位于启动子，故错误。

C项，在细胞培养液中加入抗生素，只有含胰岛素基因的受体细胞才能存活，即借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来，故正确。

D项，启动子在胰岛素基因的转录中起作用，终止密码子在翻译中起作用，故错误。

10．已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产，乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。

因此，可将丙种蛋白质基因转入到甲种农作物体内，使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。

回答下列问题：

（1）为了获得丙种蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出丙种蛋白质的________序列，据此可利用________________方法合成目的基因。

获得丙种蛋白质的基因还可用________和________方法。

（2）在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需要使用________酶和________酶。

（3）将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗________的危害。

（4）若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子________（填“含有”或“不含”）丙种蛋白质基因。

（1）为了获得丙中蛋白质的基因，在已知丙种蛋白质氨基酸序列的基础上，推测出控制丙中蛋白质的基因的核苷酸序列，据此可利用化学方法合成目的基因。

获得丙中蛋白质的基因还可用基因文库、PCR方法。

（2）在利用上述丙中蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中，常需使用限制酶和DNA连接酶。

（3）将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共培养，筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织，由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗乙种昆虫的危害。

（4）若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口，则该植株的种子不含丙种蛋白质基因，因为基因不能跨细胞转移。

（1）基因的核苷酸　化学　基因文库　PCR

（2）限制　DNA连接

（3）乙种昆虫　（4）不含

11．转基因生物可用于生产人类所需要的药用蛋白，如激素、抗体、疫苗、酶等。

下图甲是通过生物工程培育能产生人胰岛素的烟草的过程。

请据图回答下列问题：

图甲

（1）基因工程的核心步骤是________（填字母）。

此过程所需的工具酶是________。

（2）下图乙是载体和反转录得到的胰岛素基因的片段，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。

GeneⅠ和GeneⅡ为质粒上的标记基因，根据图示分析，应用限制酶________切割质粒，用限制酶________切割目的基因。

构建的重组质粒中，除含有外源基因、标记基因外，还必须含有________和________。

图乙

（3）B过程中，常用________处理使细菌成为感受态细胞，从而利于重组质粒的导入。

（4）如果从分子水平检测人胰岛素基因是否表达成功，可以采用____________方法。

（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即A过程，该过程首先需要限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和运载体，还需用DNA连接酶将目的基因与运载体连接形成重组DNA分子。

（2）用限制酶Ⅱ切割质粒时会将两个标记基因都破坏，因此只能选用限制酶Ⅰ切割质粒，而切割含有目的基因的外源DNA分子时，只需用限制酶Ⅱ即可，构建的重组质粒中，除含有外源基因、标记基因外，还必须含有启动子和终止子。

（3）将目的基因导入微生物细胞时，常用感受态细胞法，即常用Ca2＋处理使细菌成为感受态细胞，从而利于重组质粒的导入。

（4）从分子水平上检测目的基因是否表达成功，可以采用抗原—抗体杂交方法。

（1）A　限制酶和DNA连接酶

（2）Ⅰ　Ⅱ　启动子　终止子

（3）Ca2＋

（4）抗原—抗体杂交

12．中国科学家成功将人肝再生增强因子（hALR）的基因导入羊的乳腺上皮细胞中，再利用核移植技术培育出了转基因克隆羊，其乳汁含有hALR，请回答下列问题：

（1）从人的肝细胞中获取所有mRNA，并以此为模板反转录产生多种DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，该受体菌群体叫作人的________文库，从该文库中获得hALR基因，这样获得的基因与人的肝细胞中的hALR基因相比________（填“有”或“没有”）区别。

（2）得到hALR基因后，若要较快地得到大量的hALR基因，一般采用PCR技术扩增，扩增过程包括：

目的基因解旋为单链、________________、在________酶作用下延伸，如此重复循环，如下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。

（3）目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是转基因生物的DNA上是否_____________________________________________。

（4）人的hALR基因能够在羊乳腺细胞表达出相同的hALR，说明所有生物____________________________________________。

（1）以mRNA为模板，通过逆转录方法产生多种cDNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，该受体菌群体叫作cDNA（部分DNA）文库；

从部分基因文库中获取的DNA没有启动子、内含子和终止子等，因此这样获得的基因与人的肝细胞中的hALR基因相比有区别。

（2）PCR技术扩增过程包括：

目的基因解旋为单链、引物与单链相应互补序列结合、在热稳定DNA聚合酶作用下延伸，如此重复循环，由于DNA分子的两条链是反向平行的，且延伸总是从3′－5′，若图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，则另一条引物的位置及扩增方向。

如图所示：

（3）目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。

（4）由于生物共用一套遗传密码子，因此人的hALR基因能够在羊乳腺细胞表达出相同的hALR。

（1）cDNA（部分DNA）　有

（2）引物与单链相应互补序列结合　Taq（热稳定DNA聚合或DNA聚合）

（3）插入了目的基因　（4）共用一套密码子

13．S多肽是构成乙肝病毒的主要成分，现利用基因工程制造乙肝疫苗。

据此回答下列问题：

（1）利用PCR技术扩增S基因前，需根据S基因的核苷酸序列设计________种引物，进行PCR时需先加热至90～95℃然后冷却至55～60℃，此操作的目的是__________________________________

（2）将S基因插入质粒中（如下图所示）构建基因表达载体时，需要在S基因前后两端分别引入____________的酶切位点，目的是________________（答出一点即可）。

（3）用分子杂交技术检测S基因是否转录出mRNA的具体操作过程是___________________________________________________，

若______________，则表明转录出了mRNA。

（4）乙肝疫苗的接种需要在一定时期内间隔注射3次，其目的是使机体产生更多的________________________________________。

（1）2（两）　使DNA解旋为单链，然后使引物结合到互补DNA链上

（2）XbaⅠ和SacⅠ　防止目的基因（S基因）自身环化、防止目的基因（S基因）反向连接（答出一点即可）

（3）从受体细胞中提取mRNA，用标记的S基因做探针，与mRNA杂交　显示出了杂交带

（4）抗体和记忆（B）细胞