上海交通大学分子生物学技术综合实验讲义Word文件下载.docx
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5.恒温水浴器
(二)材料
1.氨苄青霉素
2.大肠杆菌DH5
3.pUC19
4.1.5mL离心管
5.枪头、枪
6.试管、培养皿
(三)试剂
1.快速感受态细菌制备试剂盒(申能博彩公司产品)
2.LB培养液
在950mL去离子水中加入:
胰蛋白胨(tryptone)10g
酵母提取物(yeastextract)5g
NaCl10g
摇动容器直至溶质完全溶解,用Na0H调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。
3.氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成100mg/mL溶液,置-20℃冰箱保存。
[实验步骤]
1.从大肠杆菌DH5平板上挑取一个单菌落接于2mLLB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜。
2.取50L菌液转接到一个含有5mLLB培养液锥形瓶中,37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3.用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中,冰上放置3分钟后,加入0.5mL预冷的SolutionSS。
在冰上小心地用1mL枪头将细胞悬浮起来。
注意:
1mL的取液器设定在500L。
悬浮细胞要轻,防止细胞进入枪内。
4.将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷)中,每管0.1mL。
细胞可以立即使用或储存。
5.将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。
在转移过程中要防止温度升高,解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块,将细胞迅速转移到塑料里,将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化:
1.新鲜制备的或-20℃下保存的100L感受态细胞,置于冰上,完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2.加入5LpUC19质粒,DNA浓度为10pg/L,轻轻混匀。
3.冰上放置30分钟。
4.42℃水浴热激60秒。
5.冰上放置2分钟。
6.加400LLB培养液,37℃250转/分振荡培养30分钟。
7.室温下4000rpm离心5分钟,用枪头吸掉400L上清液,用剩余的培养液将细胞悬浮。
8.将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上。
9.平皿在37℃下正向放置1小时,待接种的液体吸收进琼脂后,将平皿倒置,培养过夜。
[实验结果]
经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。
计数菌落总数,计算制备的感受态菌的转化效率,以每g质粒DNA转化的菌落数表示。
实验二质粒DNA的提取
[实验原理]
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线状的DNA双螺旋结构解开变性,在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂,但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性,而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开,不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。
通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来,而质粒DNA却留在上清液中。
(一)仪器
1.恒温培养箱
3.小型高速离心机
4.高压灭菌锅
(二)材料
1.带有pQE-31质粒和pUC18-CAT质粒的两株大肠杆菌
2.1.5mL离心管
3.枪头、枪
(三)试剂
质粒小量制备试剂盒(3SSpinplasmidMIniprepKitV3.1,申能博彩公司)
试剂盒的参考配方:
SolutionI
50mmo1/L葡萄糖
5mmo1/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·
HCl(pH8.0)
1.0mmo1/L乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
SolutionII
0.4mo1/LNa0H,2%SDS(十二烷基硫酸钠),用前等体积混合
SolutionIII
5mo1/L醋酸钾60mL
冰乙酸11.5mL
水28.5mL
TE缓冲液
10mmo1/LTris·
HCl
1mmo1/LEDTA(pH8.0)
胰RNA酶(RNA酶A)
将RNA酶溶于10mmo1/LTris·
HCl(pH7.5)、15mmo1/LNaCl中,配成10mg/mL的浓度,于100℃加热15min,缓慢冷却至室温,保存于-20℃。
(一)提取质粒
将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中,分别接入含pQE-31质粒和pUC18-CAT的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。
以下的操作按试剂盒的说明书进行。
(附试剂盒说明书)
(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳
将5L洗脱液与3L的DNA样品缓冲液混合,加于1.2%Agarose做凝胶电泳分析。
附:
试剂盒说明书
3SSpinPlasmidMiniprepKitV3.1
上海申能博彩生物科技有限公司
bbst@shl63.net
试剂盒组成:
组成
K1910(50次)
K1920(100次)
K1930(250次)
SolutionI(a)
5m1
10m1
25m1
SolutionII(b)
20m1
50ml
Solutionlll
50m1
2x50m1
WashSolution(c)
22m1
2x22m1
5x22m1
TE(d)
40m1
3SColumn
50支
100支
250支
Co11ectiontube
250根
说明书
1份
l份
注:
a)SolutionI内含RNaseA,每次实验结束后,4℃保存。
b)温度低时,SoluionII有白色沉淀析出,37度以下保温溶解,摇匀后使用。
c)首次使用前,必须在WashSolution瓶中加入50ml无水乙醇,充分混勾后使用。
每次使用后将瓶盖旋紧,以保持WashSolution中的乙醇含量。
d)TEpH8.0或者水均可以用十洗脱,但是用水洗脱DNA,效率通常要低—些。
抽提测序用质粒需要用水洗脱。
主要特点:
●采用改良的碱裂解方法,质量稳定,重复性好。
●经济快速,每个抽提可以在20分钟内完成。
●无需酚抽提,无需乙醇沉淀,无需CsCl离心。
●质粒纯度高,洗脱体积小,适合于DNA全白动荧光测序。
实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)
1.将过夜培养的2m1细菌,测序用质粒抽提请用5m1细胞,高速离心1分钟,彻底去除上清。
2.加入100lsolutionI,用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意:
对于低拷贝数的质粒,请用5m1细胞;
质粒如果用于全自动荧光测序分析,请用5ml细胞,无需提高SolutionI,II和III的用量。
3.加入200lSolutionII,立即上下颠倒或用手指弹管底,使细菌裂解,室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4.加入400lSolutionIII,立即上卜颠倒5—10次,使之充分中和,室温放置2分钟。
步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5.高速离心,15,000转/分钟,10分钟。
无需低温离心。
提高离心速度,使沉淀更加紧密,步骤6操作取上清更为方便。
6.取出2m1样品收集管和3S柱,在管壁标上样品号,将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。
盖上离心管盖子(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),室温放置2分钟(室温放置时间不重要,可长可短);
用台式离心机室温高速(12,000转/分钟)离心1分钟。
转移上清时不要吸取沉淀,否则会出现GenomicDNA和蛋白质污染。
离心管盖子盖上时,柱子内压的增加,可能会使部分溶液从柱子底部流出,为正常现象。
7.取下3S柱,弃去掉收集管中的废液,将3S柱放入同一支收集管中,吸取700lWashSolution到3S柱,离心1分钟。
8.重复步骤7一次。
9.取下3S柱,弃去掉收集管中的废液,将3S柱放入同—支收集管中,高速离心2分钟。
10.将3S柱放入干净的1.5m1的离心管中,在3S柱子膜中央加50lTE或水,不要盖上离心管盖,室温下放置2分钟;
盖上离心管盖,室温高速离心1分钟。
将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。
测序用质粒用30l预热的水洗脱,浓度一般满足测序要求。
11.洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。
lml过夜培养细胞,质粒如果用50l水洗脱,通常情况下可以取10l洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。
实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳
[实验原理]
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型,具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样,迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。
一般提取的质粒有3种构型:
超螺旋的共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA),开环DNA,即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂,(opencircularDNA,简称ocDNA),线状质粒DNA,即质粒DNA在同一处两条链都发生断裂(linearDNA,简称LDNA)。
由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带,其中超螺旋质粒DNA泳动最快,其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。
2.琼脂糖凝胶电泳系统
5.紫外核酸检测仪
1.pQE-31和pUC18-CAT质粒
1.50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)
配1000mL50xTAE:
Tris242g
冰醋酸57mL
0.5mol/LEDTA200mL
pH8.0
2.凝胶加样缓冲液(6x)
溴酚蓝0.25%
蔗糖40%
3.琼脂糖
4.溴化乙锭溶液(EB)0.5µ
g/mL
5.250bpDNA分子量标准
[实验步骤]
(一)制备琼脂糖凝胶
根据被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
可参照下表:
琼脂糖凝胶浓度%线性DNA的有效分离范围/kb
0.35—60
0.61—20
O.70.8—10
O.90.5—7
1.20.4—6
1.50.2—4
2.00.1—3
实验用1.2%琼脂糖。
称取1.2g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入100mL1xTAE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀即可。
(二)胶板的制备
1.取干净的有机玻璃内槽,用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。
2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4.待胶凝固后,小心地拔出梳子,撕下透明胶带,然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。
DNA样品孔应朝向负电极一端。
5.加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。
(三)加样
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
(四)电泳
1.接通电泳槽与电泳仪的电源。
DNA的迁移速度与电场强度成正比,一般电场强度不要超过5V/cm。
2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处,停止电泳。
(五)染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可),在脱色摇床上缓慢摇动下染色20-30分钟。
溴化乙锭为致癌物,须戴一次性塑料薄膜手套操作,并小心污染环境。
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。
DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜,以防紫外线对眼睛的伤害作用)。
实验四DNA重组
DNA重组是将外源DNA与载体分子连接,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起,而且能使平末端的双链DNA分子连接起来,但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切,为了防止载体本身的自身连接,可以用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理,去掉酶切后5'
端的磷酸。
这样做能有效防止质粒的自身环化,降低转化的背景,大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性,但是在这样的温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。
一般的连接条件是在12-16℃,反应12-16小时(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后,还须对转化菌落进行筛选鉴定,挑选出所需的重组质粒。
1.恒温摇床
2.恒温水浴
3.恒温培养箱
4.小型高速离心机
1.氨苄青霉素
2.BamHI
3.HindIII
4.T4DNA连接酶
5.pQE-31和pUC18-CAT质粒
6.培养皿
7.接种针
8.金属涂棒
9.1.5mL离心管
10.酒精灯
11.镊子、灭菌牙签等
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒(3SSpinDNAAgaroseGelPurificationKit,申能博彩公司)
(一)质粒DNA
用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT质粒。
(二)制备重组DNA
1.在灭菌的1.5mL离心管中,加入pQE-31质粒10L(2g/L),2L酶切缓冲液,1LBamHI和HindIII酶的混合液(各含10个单位),无菌双蒸水7L,至反应混合物总体积为20L,离心混匀,37℃反应过夜。
2.在另一无菌1.5mL离心管中,加pUC18-CAT质粒20L,加入3L酶切反应液,lLBamHI和HindIII酶的混合液,无菌双蒸水补到30L,37℃反应过夜。
3.反应完毕后取5LpQE-31质粒的酶切液做电泳分析,检验酶切是否完全。
酶切完全,进行下一步。
4.将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT质粒,分别上样跑琼脂糖凝胶电泳(注意加DNA分子量标准)。
电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。
前者回收的片段为3.5kb,后者为650bp。
5.将回收的pQE-31载体质粒均分为两份,其中一份与酶切后回收的CAT片段混合,做连接;
另一份不加CAT片段,做对照。
操作如下:
在10LDNA样品中,加T4DNA连接酶缓冲液1L,T4DNA连接酶1L,14℃(室温)过夜,然后做大肠杆菌的转化。
(三)转化感受态细胞
1.用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2.在100L的融化后处于冰浴的感受态细胞中,加入10L连接产物,混匀,冰上放置30分钟,以后的操作参照实验一进行。
同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。
过夜培养后,实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。
如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落,则是好征兆,但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。
3SSpinDNAAgaroseGelpurificationKit
WWW.
试剂盒组成
K131(50次)
K132(100次)
K133(250次)
3SCo1umn
CollectionTube
SolutionSN
SolutionB
WashSolution(a)
TE
30m1
60m1
2X22m1
150m1
5X22m1
注:
(a)首次使用前,必须在WashSolution瓶中加入50ml无水乙醇,充分混匀后使用。
每次
使用后将瓶盖盖紧,以保持WashSo1ution中的乙醇含量。
(b)TEpH8.0或者水均可以用于洗脱,测序样品请用水洗脱。
试剂盒DNA回收率:
3S柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率,回收率在60%以上。
主要用途:
(a)TBE或TAEAgarose胶中回收DNA片段。
(b)从溶液中回收和浓缩DNA,去除反应体系中的蛋白质。
操作步骤
从Agarose胶中回收DNA:
1.用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开,然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块,放入1.5m1离心管中。
判定DNA片段的位置时,要尽可能使用长波长UV,在UV下照射的时间应尽可能短。
2.按每100mgAgarose胶加入400lSolutionSN,置于55-65℃水浴中5分钟,中途混匀,至胶完全融化。
胶融化后每400lSolutionSN加入100lSo1utionB,混匀。
注意;
高浓度的胶(1.5-2%),每100mg胶加入500lSolutionSN,加热融胶的时间延长到15分钟,以保证胶全部融化,胶融化后加入100lSolutionB,混匀。
3.将3S柱放入2m1收集管中,将融化的胶溶液转移到3S柱中,让盖子开着,室温放置2分钟。
盖上离心管盖(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),室温离心(10,000rpm)1分钟。
4.取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一个收集管中,加入600lWashSolution,室温离心(10,000rpm)1分钟。
5.重复步骤4一次。
6.取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一个收集管中,室温高速离心(10000rpm)2分钟。
7.将3S柱放入一根新的1.5m1离心管中,在3S柱子膜中央加入30lTE或水,室温放置2分钟。
提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。
也可以用预热的TE或水洗脱。
8.盖上离心管盖(盖子也可以不盖,但是如果您同时有很多样品,担心混淆或弄翻溶液,建议您盖上盖子),10,000rpm高速离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片段,可立即使用或保存于-20℃备用。
从溶液中回收和浓缩DNA:
1.根据溶液的体积和所要回收DNA的含量,加入5倍体积的SolutionSN。
如果溶液的体积不足100l,加TE补足到100l,再加500u1SolutionSN和100lSolutionB,混匀;
2.以下同从Agarose胶中回收DNA的步骤3-8。
实验五转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查
一般情况下,可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。
以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。
操作方法如下:
1.使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。
2.用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分,在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。
至少挑选20个左右的菌落照此划线,平板于37℃培养过夜,然后保存于4℃,直到相应菌落的回收。
3.在划线培养的同时,将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50L灭菌的10mmo1/LEDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。
4.每管加50L配制的0.2mo1/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液,振荡30秒。
5.于70℃温育5分钟,然后冷却到室温。
6.加3L2mol/
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