细菌生长曲线的测定的实验步骤Word下载.docx
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1.准备菌种:
将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中,37℃振荡培养18h,另外准备单菌落平板各1块
2.分为三个小组:
第
(1)小组
取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃200rpm
取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃200rpm
取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃200rpm
第
(2)小组
取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基,37℃200rpm
取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃110rpm
取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基,30℃200rpm
第(3)小组
取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,37℃200rpm
取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,30℃200rpm
取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,37℃110rpm
每培养一小时取样一次(2.5h,3.5h加测1次).对照组测量起始pH,所有瓶子测量发酵9h结束测pH.
3.测量:
选用600nm波长,以蒸馏水作为参比,开始培养前测定每组培养液的OD值作为起始点。
开始培养后,每小时吸取测定一次OD值。
五、实验结果及分析
1.实验数据:
表一三个小组时间-OD数据
开始取样时间
10:
55
12:
01
39
13:
17
53
结束取样时间
9:
11:
09
47
23
59
发酵时间
1
2
2.5
3
3.5
ODt
大肠杆菌
单菌落
0.004
0.024
0.027
0.025
0.036
37℃110rpm
-0.010
0.049
0.164
0.255
0.312
0.327
30℃200rpm
0.043
0.088
0.158
0.242
0.361
1.0mL
0.010
0.070
0.266
0.372
0.436
3.0mL
0.039
0.096
0.257
0.373
0.420
0.451
5.0mL
0.067
0.134
0.302
0.334
0.456
枯草杆菌
37℃200rpm
0.008
0.023
0.076
0.132
0.184
0.254
0.013
0.032
0.052
0.091
0.125
0.007
0.017
0.098
0.130
0.230
0.253
OD=ODt-OD0
0.020
0.021
0.059
0.174
0.265
0.322
0.337
0.053
0.168
0.252
0.371
0.060
0.148
0.256
0.362
0.426
0.057
0.218
0.381
0.412
0.235
0.294
0.267
0.389
0.015
0.068
0.124
0.176
0.246
0.019
0.075
0.078
0.112
0.123
0.223
14:
29
15:
35
16:
43
17:
50
18:
57
19:
07
20:
12
21:
4
5
6
7
8
9
10
0.065
0.395
0.454
0.457
0.333
0.340
0.342
0.360
0.439
0.566
0.570
0.588
0.586
0.464
0.446
0.458
0.440
0.487
0.470
0.483
0.469
0.482
0.478
0.428
0.517
0.590
0.686
0.711
0.171
0.261
0.370
0.540
0.628
0.606
0.652
0.295
0.305
0.352
0.378
0.061
0.263
0.391
0.450
0.453
0.343
0.350
0.449
0.576
0.580
0.598
0.596
0.448
0.430
0.431
0.418
0.444
0.419
0.402
0.390
0.397
0.415
0.411
0.329
0.509
0.582
0.678
0.703
0.248
0.357
0.527
0.615
0.593
0.639
0.288
0.298
0.345
2.作图、简要分析及代时计算:
1)取一个大肠杆菌菌落接种到100ml培养基,37℃200rpm
图一单菌落大肠杆菌生长曲线
这条曲线属于比较标准的“S”形曲线,很容易看出调整期和对数期,由于单菌落菌较少,而且从固体培养基转移至液体培养基环境变化较大,所以出现了长达4小时的调整期,但可以看出,调整期之后这瓶菌都生长良好。
计算代时:
取培养4小时到5小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。
由代时计算公式,t2-t1=1hW1=0.061W2=0.263
代时
2)取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃110rpm
图二大肠杆菌菌生长曲线(取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基,37℃110rpm)
接种后几乎没有调整期出现,大肠杆菌很快适应了新的环境并开始呈指数增长,估计是新的培养环境和原有环境较一致,而且在培养最初的时候溶氧和酸碱度都较为适宜,但是这瓶菌是稳定期OD最小的,估计是培养基最初分装不均产生的。
取培养2小时到2.5小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。
由代时计算公式,t2-t1=0.5hW1=0.174W2=0.265
3)取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,30℃200rpm
图三大肠杆菌生长曲线(取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基,30℃200rpm)
可以看出温度对大肠杆菌适应环境产生了一定的影响,使它在调整期滞留了较长的时间,且在对数期增长较慢,应该是酶活性对细胞复制的影响所致。
取培养2.5小时到3.5小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。
由代时计算公式,t2-t1=1hW1=0.168W2=0.371
4)取1.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃200rpm
图四大肠杆菌生长曲线(取1.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基,37℃200rpm)
这是大肠杆菌培养的最适调节,可以看出其生长良好,调整期较短,对数期较长。
取培养2小时到3小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。
由代时计算公式,t2-t1=1hW1=0.148W2=0.362
5)取3.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃200rpm
图五大肠杆菌生长曲线(取3.0ml大肠杆菌接种到100ml培养基,37℃200rpm)
接种量的增加没有产生太大的影响,生长曲线没有太大变化。
由代时计算公式,t2-t1=0.5hW1=0.218W2=0.334
6)取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃200rpm
图六大肠杆菌生长曲线(取5.0ml大肠杆菌菌液接种到100ml培养基,37℃200rpm)
3小时出现了一次明显的波动,应该是测量过程中没有摇匀的结果,忽略它之后,这条生长曲线属于正常形态,比较前两天生长曲线,发现5mL得到的最大OD反而减小了,说明在一定量的培养基下,初始接种量对最后结果影响不大。
最大OD应该是受到了最初添加培养基的影响。
取培养1小时到2小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。
由代时计算公式,t2-t1=1hW1=0.067W2=0.235
7)取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,37℃200rpm
图七枯草杆菌生长曲线(取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,37℃200rpm)
枯草杆菌的生长曲线包含了调整期、对数期和很小一部分稳定期,虽然稳定期很短,但是已经可以看出停止生长的趋势,说明枯草杆菌的代时较长。
取培养3小时到4小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。
由代时计算公式,t2-t1=1hW1=0.176W2=0.246
8)取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,30℃200rpm
图八枯草杆菌生长曲线(取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,30℃200rpm)
温度降低后,生长变得缓慢了,最后达到的最大OD也更小了,代时加长。
由代时计算公式,t2-t1=1hW1=0.158W2=0.248
9)取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,37℃110rpm
图九枯草杆菌生长曲线(取1.0ml枯草杆菌接种到100ml培养基,37℃110rpm)
4小时时,似乎由对数期进入了稳定期,但是对比前两组数据,此时的OD值明显偏小,所以分析,可能此时突然有外因影响,使细胞进入了调整期,可以看到后来7、8小时左右细菌又有增长趋势。
取培养2.5小时到3小时之间的数据(对数生长期)来计算代时。
由代时计算公式,t2-t1=1hW1=0.123W2=0.223
3.发酵结束pH
对照组pH=7.5
实验结束后所有瓶pH均小于6.4
pH全部降低,说明大肠杆菌和枯草杆菌发酵均产生了酸。
4.分析
表二不同环境和菌种生长比较
培养菌
接种量
培养温度/℃
摇床转速/rpm
生长曲线状态
代时/min
调整期/h
对数期/h
稳定期OD(取8小时OD)
37
200
28.5
110
49.4
30
52.5
46.5
48.7
33.1
66.5
92.2
34.9
1)接种量对微生物的影响:
预期:
接种量大,调整期缩短,对数期增长,稳定期OD增大,代时缩短。
原因:
接种量大的细胞基数大,因而更快适应环境。
实际:
调整期影响不大,对数期稍有缩短,稳定期OD减小,代时规律不明显。
分析:
生长曲线受各种因素调节,这里实验结果不同于预期应该是受到培养基的限制,接种量大对氧气和原料需求更多,而且产生酸的速度也快,也许对后来的细胞生长造成了一定的影响。
2)培养温度对微生物的影响
最适温度下细胞生长应该最快,调整期最短,稳定期OD最大,代时最短
温度影响细菌内酶活力和细胞膜的通透性,进而影响新陈代谢,从而影响细菌的生长繁殖。
最适温度下,细菌酶活性最强,因而能最快适应环境,并取得生长增殖的最高效率。
大肠杆菌37℃稳定期OD最大,调整期更短,但代时更长。
枯草杆菌37℃调整期更短,对数期更长,稳定期OD更大,代时更短。
大肠杆菌代时的问题应该来自实验误差,如取样未摇匀、计算时取点不够准确,或实验过程中某些操作导致生长和理论不一致。
3)摇床转速对微生物的影响
转速高,调整期短,对数期长,稳定期OD大,代时短
转速影响溶氧,溶氧高,生长情况应该越好
大肠杆菌与预期符合;
枯草杆菌转速快的调整期长,代时长。
原因可能有两点,一是枯草杆菌在溶氧高的环境下生长没有那么好,说明它是微好氧生物,但这与实际不符;
二是其他条件限制,虽然说两个培养瓶进行对照要求其他条件一致,但是由于培养基分配及其其他各种原因,其他条件可能并不一致而且还产生了比对照条件还要大的影响。
4)生长曲线分析
两个菌的生长曲线都包括了调整期、对数期和稳定期,实验没有进行到衰亡期因为而没有观察到后来的OD值下降。
5)大肠杆菌和枯草杆菌比较
大肠杆菌:
代时要短一些,温度对代时的影响比溶氧对代时的影响要大,估计是因为溶液中细胞不多,所以溶氧的限制作用没有温度明显。
枯草杆菌:
代时较长,溶氧比温度对代时的影响要大,但这也可能是实验操作中其他因素影响而得出的表观结果。
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